Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

शारीरिक, आंदोलन द्वारा संग्राहक न्यूरॉन्स के morphological और neurochemical विशेषता

Published: April 21, 2011 doi: 10.3791/2650

Summary

आंदोलन के दौरान स्तनधारी न्यूरॉन्स के vivo शारीरिक प्रतिक्रिया में यों और neuronal आकारिकी, neurochemical phenotype और synaptic microcircuitry के साथ न्यूरॉन के शरीर क्रिया विज्ञान सहसंबंधी एक तकनीक वर्णित है.

Protocol

1. पशु तैयारी

  1. Pentobarbital सोडियम (50mg/kg आईपी) और एक हीटिंग पैड पर जगह के साथ चूहे anesthetize. जानवरों की क़ैंची के साथ पीछे खोपड़ी overlying त्वचा दाढ़ी. विश्वास दिलाता हूं कि संज्ञाहरण के स्तर के एक शल्य चिकित्सा स्तर एक वापसी पलटा और वोकलिज़ेशन के अभाव के लिए किया गया है परीक्षण के द्वारा प्राप्त जब पैर की उंगलियों pinched नेत्रच्छद पलटा के अभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं जानवर की जाँच करें. हर 15 मिनट के संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करें और सोडियम pentobarbital 15mg/kg के इंजेक्शन हर 45 मिनट द्वारा anesthetisa की शल्य चिकित्सा स्तर को बनाए रखने.
  2. सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें और एक चीरा वंक्षण क्षेत्र में सिर्फ पेट और जांघ द्वारा गठित क्रीज पर बाहर का बनाने के लिए और ऊरु नस में एक प्रवेशनी (1mm व्यास, क्ले एडम्स), और और्विक धमनी सम्मिलित. अवअधोहनुज क्षेत्र में एक midline चीरा बनाओ, infrahyoid मांसपेशियों को प्रतिबिंबित. ट्रेकिआ में एक छोटा सा चीरा और एक प्रवेशनी (2mm व्यास) सम्मिलित करने के लिए वेंटिलेशन की अनुमति. Trachael के चारों ओर एक सिवनी place.Monitor प्रणालीगत डायस्टोलिक और सिस्टोलिक धमनी प्रवेशनी के माध्यम से रक्तचाप में सुरक्षित cannual Tye. वापसी और नेत्रच्छद पलटा निगरानी के अलावा अब रक्त दबाव की निगरानी के लिए संज्ञाहरण के स्तर का आकलन. अतिरिक्त संज्ञाहरण प्रशासन जब शिरापरक प्रवेशनी के माध्यम से की जरूरत है.
  3. एक stereotaxic फ्रेम में चूहे प्लेस और सेरिबैलम बेनकाब craniotomy प्रदर्शन. एक कृंतक वेंटीलेटर tracheal प्रवेशनी संलग्न. Humidified हवा के साथ 100/min की दर पर 2 3 सेमी की एक मात्रा के साथ पशु हवादार . 1 सेमी एच 2 हे का एक सकारात्मक अंत expiratory दबाव फेफड़ों के पतन को रोकने के लिए रखा जाना चाहिए. हर 15 मिनट फेफड़ों hyperinflate श्वासरोध को रोकने के लिए. फिर गर्म खनिज तेल (30 डिग्री सेल्सियस) के साथ मस्तिष्क की सतह को कवर किया. बड़े शिरापरक पार्श्विका और interparietal हड्डियों के बीच जंक्शन के तहत सीधे स्थित साइनस से बचने के लिए सावधान रहें.
  4. एक एक विद्युत चुम्बकीय थरथानेवाला मिलकर रॉड cyanoacrylate गोंद लागू करें और जबड़े की diastema में रॉड देते हैं. थरथानेवाला के लिए या तो एक ए / डी कंप्यूटर उत्पादन या एक संकेत जनरेटर से जबड़ा का उपयोग कमांड संकेतों को ले जाएँ.
  5. Craniotomy करने के लिए आसन्न त्वचा के नीचे एक siliver चांदी क्लोराइड ग्राउंडिंग इलेक्ट्रोड रखें.

2. इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. एक क्षैतिज microelectrode खींचने का उपयोग क्वार्ट्ज या aluminosilicate कांच से microelectrodes बनाना.
  2. 5-10% KCl और 0.5m 0.25M Tris एचसीएल (7.6 पीएच) बफर tetramethlyrhodamine या खारा में 2% (6 पीएच) में भंग biotinamide साथ microelectrode भरें. एक इलेक्ट्रोड परीक्षक के साथ इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा की जाँच करें. 60-80m Ω प्रतिबाधा के साथ बड़े व्यास axons से रिकॉर्ड करने के लिए इलेक्ट्रोड बनाने के लिए, छोटे axons और interneurons 80-150MΩ प्रतिबाधा के साथ इलेक्ट्रोड बनाने.
  3. Electrometer के सिर चरण में microelectrode रखें. जो जानवर के सिर के पीछे की स्थिति में तय हो गई है एक छोटा सा (एक संलग्न लजीला व्यक्ति के साथ 20X) दूरबीन के माध्यम से इलेक्ट्रोड कल्पना. दूरबीन का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इलेक्ट्रोड stereotaxically महान परिशुद्धता के साथ तैनात की अनुमति देता है.

3. Electrophysiological रिकॉर्डिंग और intracellular धुंधला

  1. पिया मेटर में एक छोटे से खोलने और समाई प्रतिक्रिया भरपाई इतना है कि जब इलेक्ट्रोड मस्तिष्क छू एक प्रतिक्रिया संकेत उत्पादन किया है. यह मस्तिष्क की सतह के सटीक स्थान की अनुमति देता है.
  2. दोहराया जबड़े विस्थापन निर्माण और मस्तिष्क में एक कदम मोटर के साथ इलेक्ट्रोड अग्रिम.
  3. डीसी क्षमता में अचानक बूँदें द्वारा neuronal impalements पहचानो और चल रहे synaptic गतिविधि के द्वारा intrasomatic neuronal impalements की पहचान. समाई के overcompensation के साथ इलेक्ट्रोड गूंज या शायद ही कभी एक सफल सेल पैठ उपज दोहन. इलेक्ट्रोड के उच्च प्रतिबाधा की वजह से, neuronal प्रतिक्रियाओं को शायद ही कभी प्रवेश करने के लिए कर रहे हैं पहले मनाया.
  4. के बाद आप एक न्यूरॉन कोचना पैठ और स्थिर समझा जाता है, neuronal प्रतिक्रिया रैंप और पकड़ और sinusoidal जबड़े आंदोलन का उपयोग कर 5 नक्शा विशेषताएँ एक गैर प्रवाहकीय जांच के साथ सिर के चारों ओर की त्वचा और इंट्रा मौखिक गुहा की जांच के द्वारा न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र एक लकड़ी की छड़ी जैसे. यदि अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक है, न्यूरॉन की मांसपेशी संकुचन और हानिकारक उत्तेजनाओं के रूप में अन्य कार्यात्मक प्रासंगिक stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया की जांच 6 प्राथमिक अभिवाही nociceptive neuronal रिसेप्टर्स nociceptive stimuli करने के लिए जवाब है. Pentobarbital सोडियम जैसे जनरल anesthesetics प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स में axonal प्रवाहकत्त्व ब्लॉक नहीं करते बल्कि synaptic प्रसारण दबाना. इस प्रकार प्राथमिक अभिवाही neuronal अक्षतंतु में axonal प्रवाहकत्त्व संरक्षित है.
  5. 15 70nA मिनट की कुल इंजेक्शन समय के लिए वर्तमान (डीसी, 1-4nA) इंजेक्षन. वर्तमान इंजेक्शन के दौरान इलेक्ट्रोड पैठ मॉनिटर और बंद अगर झिल्ली संभावित-30mV की तुलना में अधिक सकारात्मक हो जाता है.

4. ऊतक प्रसंस्करण

  1. Pentobarbital की अधिक मात्रा (140mg/kg चतुर्थ) और perfuse से कुल्ला संवहनी (0.9% 38 NaCl के साथ पशु euthanize डिग्री सेल्सियस हेपरिन की 500 इकाइयों और 1ml 2% से युक्त xylocaine 0.1M फॉस्फेट बफर में 4% (7.4 पीएच paraformaldehyde द्वारा पीछा किया) .
  2. मस्तिष्क और 50-100μm यह अनुभाग या तो ललाट, बाण के समान या क्षैतिज प्लेन में एक vibratome का उपयोग कर निकालें. Secions 25 ° सी पीबीएस में मुक्त फ्लोटिंग एकत्र कर रहे हैं.
  3. 1-2% सामान्य बकरी सीरम में incubating और 1% ट्राइटन 0.01M पीबीएस में X-100 avidin बायोटिन परिसर में ऊष्मायन (01:50 कुलीन Vectastain) द्वारा पीछा द्वारा थपका के लिए मस्तिष्क की प्रक्रिया. एच 2 2 हे के साथ निकल थपका का उपयोग वर्गों प्रतिक्रिया . टेक्सास लाल, avidin बायोटिन पीबीएस में (01:50) परिसर 4 में रात भर में सेते वर्गों ° सी और फिर 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 4% टेक्सास में लाल avidin DCS PBST में सेते हैं. प्रक्रिया करने के लिए एक फ्लोरोसेंट Nissl दाग 20min (NeuroTrace) के साथ 23 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों Counterstain
  4. यदि न्यूरॉन rhodamine इंजेक्शन के साथ किया गया था, इंजेक्शन न्यूरॉन सीधे कल्पना एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (545nm पूर्व) के साथ.

5. प्रतिगामी लेबलिंग, immunocytochemistry, confocal इमेजिंग, मात्रात्मक colocalization विश्लेषण के साथ विधि मेल

अन्य तरीकों के साथ इस तकनीक के संयोजन की सफलता काफी हद तक अच्छा intracellular लेबलिंग पर निर्भर है.

  1. विधि प्रतिगामी neuronal लेबलिंग के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है कल्पना ऐसा करने के लिए 7-10, पशु anesthetize और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग, हॉर्सरैडिश peroxidase की (20% हॉर्सरैडिश peroxidase सिग्मा छठी, सिग्मा) के रूप में एक neuronal ट्रेसर इंजेक्षन और 1%. गेहूं रोगाणु masseter मांसपेशियों के रूप में परिधीय लक्ष्य क्षेत्रों में aggultinated हॉर्सरैडिश peroxidase (सिग्मा). इस neuronal ट्रेसर परिधीय axons में लिया जाएगा और motoneuron somata axonal परिवहन के माध्यम से पहुँचाया. Masseter मांसपेशियों के लिए, ट्रेसर के 15μl एक बाँझ 10 microliter microsyringe का उपयोग मांसपेशियों में अंतःक्षिप्त है. पशु तो एक हीटिंग पैड पर रखा जाता है और निगरानी तक संज्ञाहरण से बरामद किया और फिर से वसूली के लिए अपने पिंजरों में रखा. 24 घंटों के बाद, जानवरों anesthetize और physiologically न्यूरॉन्स विशेषताएँ और intracellularly उन्हें दाग. फिर जानवर एचआरपी की उपस्थिति chromagen और स्टेबलाइजर और कोबाल्ट के साथ तेज के रूप में सोडियम tungstate के रूप में tetramethylbenzidine (TMB) का उपयोग करने के लिए ऊपर के रूप में और प्रक्रिया ऊतक वर्गों वर्णित perfuse. प्लेस वर्गों में 1% सोडियम 0.1M पीबीएस (6.5 पीएच) और ०.०,००७% 15 में पूर्ण इथेनॉल और एसीटोन में भंग TMB में भंग tungstate डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए. फिर 0.3% एच 2 2 हे 100ml 60 मिनट के लिए ऊष्मायन समाधान के प्रति 1.0 मिलीलीटर जोड़कर ऊतक वर्गों प्रतिक्रिया. 0.05% diaminobenzidine (7.4 पीएच), कोबाल्ट 0.02%, और 0.01% एच 2 2 हे 0.1M पीबीएस (7.4 पीएच) में 10 मिनट के लिए 0.1M पीबीएस (6.5 पीएच) में ऊतक और जगह कुल्ला. 37 में डिग्री सेल्सियस Biotinamide के साथ इंजेक्शन के रूप में वर्णित न्यूरॉन के दृश्य के लिए ऊतक प्रक्रिया और लेबल संवेदी न्यूरॉन और motoneurons की एक किस्म के बीच संबंधों कल्पना.
  2. यहाँ दिखाया तकनीक भी आसानी से immnocytochemistry साथ संयुक्त कर सकते हैं 6. एक उदाहरण के रूप में, immunocytochemically synaptophysin के लिए मस्तिष्क की प्रक्रिया करने के लिए सही लेबल न्यूरॉन्स के भीतर synapses (3 छवि ) का पता लगाने. ऐसा करने के लिए, माउस विरोधी synaptophysin एंटीबॉडी (1:10,000) में 4 में 2 दिन ° सी. सी और तो 1 के लिए विरोधी माउस FITC (1:400) में 23 ° सेते के लिए मस्तिष्क वर्गों सेते
  3. फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ लेबल या फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए संसाधित न्यूरॉन्स confocal इमेजिंग के लिए आदर्श होते हैं. चित्रा 3 एक ऑप्टिकल अनुभाग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ एक अक्षतंतु bouton के माध्यम से प्राप्त की एक उदाहरण है. (3 छवि). लेबल न्यूरॉन (4 छवि) के माध्यम से कई ऑप्टिकल वर्गों द्वारा प्राप्त लेबल न्यूरॉन्स की एनिमेशन उत्पन्न करता है.
  4. इस विधि के साथ लेबल न्यूरॉन्स मात्रात्मक colocalization विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, एनआईएच छवि के साथ संयोजन के रूप में एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर मैक्रो का उपयोग करें (http://phy.ucsf.edu/ ° आईडीएल / colocalization.htm में पाया). एकल अक्षतंतु टर्मिनलों के भीतर synaptophysin synaptophysin immunocytochemistry के साथ intracellular लेबलिंग के संयोजन द्वारा 6 स्थानीय बनाना.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

प्रतिनिधि परिणाम है कि इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है की एक सिंहावलोकन चित्रा 1 में सचित्र हैं . यह एकल brainstem न्यूरॉन electrophysiologically जबड़ा के आंदोलन के दौरान दर्ज की गई थी और के रूप में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है, इस न्यूरॉन की प्रतिक्रिया (चित्रा 1 निचले बाएँ, हल्के नीले रंग) आंदोलन के दौरान modulated था. इस न्यूरॉन electrophysiological लक्षण वर्णन के बाद biotinamide इंजेक्शन के साथ किया गया था और बाद में दृश्य के लिए संसाधित. खंगाला न्यूरॉन (चित्रा 1 मध्यम, हरा) असली किया जा सकता हैटेड एक संरचनात्मक मील का पत्थर के लिए, इस मामले में त्रिपृष्ठी मोटर नाभिक नामित (लाल रूपरेखा). आंदोलन और पुनर्निर्माण के दौरान neuronal प्रतिक्रिया के आधार पर इस न्यूरॉन एक माध्यमिक मांसपेशी धुरी अभिवाही न्यूरॉन के रूप में पहचाना जा सकता है चित्रा 2 जबड़े विस्थापन के दौरान एक न्यूरॉन की शारीरिक प्रतिक्रिया का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है.. न्यूरॉन की प्रतिक्रिया तात्कालिक फायरिंग आवृत्ति के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. ध्यान दें कि neuronal प्रतिक्रिया बारीकी जबड़े का संकेत है कि इस विशेष न्यूरॉन संवेदी जबड़े की स्थिति से संबंधित प्रतिक्रिया प्रदान करता है विस्थापन चित्रा 3 mimics. Intracellularly दाग अक्षतंतु synaptophysin के लिए धुंधला हो जाना और एक Nissl दाग के साथ संयुक्त का एक उच्च बढ़ाई छवि है. अक्षतंतु bouton भीतर synaptophysin (पीला) के colocalization नोट चित्रा 4 एक एकल, physiologically विशेषता और intracellularly लेबल न्यूरॉन के एक एनीमेशन है.

चित्रा 1
चित्रा 1 विधि का अवलोकन. ऊपरी बाएँ: जबड़े विस्थापन. एक न्यूरॉन (पीला) से मध्य Intracellular रिकॉर्डिंग (हरा). इस न्यूरॉन के morphology intracellular रिकॉर्डिंग और इंजेक्शन के बाद पुनर्निर्मित किया गया. लाल रूपरेखा त्रिपृष्ठी मोटर नाभिक के स्थान को इंगित करता है. निचले बाएँ: जबड़ा आंदोलन के दौरान इस न्यूरॉन के शारीरिक प्रतिक्रिया है.

चित्रा 2
चित्रा 2 एक एकल पेशी संवेदी न्यूरॉन vivo में जबड़ा के आंदोलन के दौरान दर्ज की प्रतिनिधि शारीरिक प्रतिक्रिया . नोट जबड़े विस्थापन के साथ neuronal प्रतिक्रिया की समानता.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक intracellularly दाग संवेदी न्यूरॉन है जो जांच मांसपेशियों के दौरान प्रतिक्रिया की synaptic BOUTONS (लाल सूजन) के साथ टर्मिनल axonal arborization. Synaptophysin के लिए बाद immunocytochemical प्रसंस्करण synaptophysin की axonal bouton (पीला) के भीतर स्थानीयकरण से पता चलता है. ग्रीन है एक फ्लोरोसेंट Nissl दाग.

चित्रा 4 मांसपेशी धुरी प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन अक्षतंतु जिनकी शारीरिक प्रतिक्रिया जबड़े आंदोलन के दौरान vivo में दर्ज किया गया था एनिमेशन अक्षतंतु तो intracellularly दाग था और दृश्य के लिए कार्रवाई की.
चित्रा 4 के एक उच्च संकल्प वीडियो यहाँ डाउनलोड करें
चित्रा 4 के एक मध्यम संकल्प वीडियो यहाँ डाउनलोड करें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ सचित्र विधि एक शक्तिशाली तकनीक है जो एकल न्यूरॉन्स के समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और कैसे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया neuronal सर्किट के लिए योगदान देता है 9 यह ज्ञान है. ज्ञानेन्द्रिय समारोह को समझने के लिए मौलिक है. इस तकनीक की सबसे बड़ी ताकत है कि फिजियोलॉजी, आकारिकी और synaptic आकारिकी और वितरण सहित एक न्यूरॉन के बारे में मानकों की एक बड़ी संख्या का निर्धारण की अनुमति देता है. जब प्रतिगामी neuronal circuitry के रूप में neuronal लेबलिंग अतिरिक्त जानकारी जैसे अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त विशेषता कर सकते हैं 7,8 इस पद्धति का एक और लाभ यह है कि यह कदम में सीखा जा सकता है. उदाहरण के लिए, intracellular रिकॉर्डिंग शुरू में आयोजित किया जा सकता है, immunocytochemistry या प्रारंभिक विधि के स्वामित्व के बाद प्रतिगामी neuronal जोडी लेबलिंग के साथ intracellular धुंधला द्वारा पीछा किया. शायद तकनीक की सबसे बड़ी सीमा यह है कि केवल न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या किसी भी एक प्रयोग में लेबल किया जा सकता है. आमतौर पर एक विशेष शारीरिक प्रकार के दो से तीन न्यूरॉन्स शुरू लेबल रहे हैं. एक बार शरीर विज्ञान और आकारिकी के बीच संभावित संबंध में तैयार की है, अतिरिक्त प्रयोगों के लिए ध्यान प्रयोगों में जो केवल एक न्यूरॉन लेबल है में इस रिश्ते की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है.

इस विधि की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम electrophysiological intracellular रिकॉर्डिंग स्थिरता को बनाए रखने है. रिकॉर्डिंग स्थिरता बहुत भिन्न न्यूरॉन के मस्तिष्क के भीतर स्थान पर अध्ययन के तहत जोड़तोड़ की एक संख्या के लिए रिकॉर्डिंग स्थिरता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर निर्भर करता है. एक वातिलवक्ष और किया जा सकता है जानवर कृत्रिम श्वसन pulsations कम हवादार. स्थिरता के बारे में 1 सेमी एच 2 ओ के एक सकारात्मक अंत expiratory दबाव लागू करने के द्वारा आगे बढ़ा सकते हैं जब मस्तिष्क के भीतर ब्याज के क्षेत्र तक पहुँच जाता है, स्थिरता सांस की मात्रा कम और श्वसन की दर बढ़ रही है जानवरों की hyperventilating द्वारा बढ़ाया जा सकता है. कुछ electrophysiological अध्ययन मस्तिष्क पर गर्म अगर लागू है और cannulated मूत्राशय, इन प्रक्रियाओं brainstem में neuronal रिकॉर्डिंग स्थिरता बढ़ाने में प्रभावी नहीं किया गया है. यह महत्वपूर्ण है बाहर बिंदु है कि इंजेक्शन बार के लिए लंबे समय होने की जरूरत नहीं है. अच्छे परिणाम के बारे में 5 मिनट के इंजेक्शन समय के साथ प्राप्त किया जा सकता है. Microelectrodes की छोटी सी टिप आकार के कारण, मस्तिष्क के भीतर इलेक्ट्रोड का टूटना आम तौर पर दरियाफ्त की एक बड़ी रिलीज का उत्पादन नहीं करता है. इसलिए इलेक्ट्रोड और प्रतिस्थापित किया जा सकता है न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक दर्ज की गई और इलेक्ट्रोड टूटना के स्थान के कई सौ microns के भीतर दाग. यदि इलेक्ट्रोड भरा है या रिकॉर्डिंग समाधान पर्याप्त रूप से इलेक्ट्रोड की नोक भर नहीं है, शोर बहुत हो सकता है और बढ़ जाएगा इलेक्ट्रोड प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा सम्मिलन से पहले परीक्षण बहुत अनुत्पादक इलेक्ट्रोड इलाकों को कम कर देता है और समय बचाता है है. यदि आप मस्तिष्क stereotaxic स्थिति के एक छोटे से क्षेत्र से रिकार्ड करने का प्रयास कर रहे हैं सर्वोपरि है. मैं एक रिकॉर्डिंग तालिका करने के लिए संलग्न करने के लिए एक निश्चित stereotaxic शून्य बनाए रखने दूरबीन का उपयोग करें. दूरबीन बहुत उपयोगी है क्योंकि इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग तालिका से जुड़ी और फिर बढ़ाई तहत देखा धारक में रखा जा सकता है है. यह microelectrode और प्रतिस्थापन इलेक्ट्रोड के zeroing के बहुत ही सटीक स्थान की अनुमति देता है.

हाल ही के अध्ययन की एक संख्या juxtacellular neuronal लेबलिंग का इस्तेमाल 11,12 एक इलेक्ट्रोड neuronal रिकॉर्डिंग और एक neuronal दरियाफ्त की विशेषताओं पर आधारित एक न्यूरॉन को निकटता में रखा गया है इस विधि के साथ निकली है. इस विधि के साथ एक स्पष्ट संभावित समस्या नकली लेबलिंग के बाद ट्रेसर इलेक्ट्रोड के आसपास के क्षेत्र में अन्य न्यूरॉन्स के axons और dendrites में शामिल किया जा सकता है. इसके अलावा, इनपुट न्यूरॉन के उत्पादन संबंधों क्योंकि extracellularly दर्ज कार्रवाई क्षमता न केवल न्यूरॉन को synaptic इनपुट लेकिन न्यूरॉन के आंतरिक गुणों से उत्पन्न किया जा सकता है है नहीं किया जा निर्धारित कर सकते हैं. साथ विधि यहाँ की सूचना दी, न्यूरॉन्स केवल जबकि microelectrode न्यूरॉन के भीतर वास्तव में है और इस तरह वहाँ कोई अस्पष्टता neuronal गतिविधि के दाग न्यूरॉन के लिए रोपण के विषय में चिह्नित कर रहे हैं. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब axons लेबलिंग क्योंकि microelectrode के नकली लेबल में एक microns कुछ परिणाम द्वारा आंदोलन. इसके अतिरिक्त, synaptic क्षमता सहित subthreshold घटनाओं impaled न्यूरॉन से दर्ज किया जा सकता है.

भविष्य के अध्ययन पैदा आंदोलनों के साथ इस पद्धति को जोड़ सकता है. उदाहरण के लिए cortical उत्तेजना इन आंदोलनों के दौरान पैदा intracellular और न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग धुंधला अनुमति चाहिए masticatory और रिकॉर्डिंग स्थिरता आंदोलनों brainstem के भीतर पैदा कर सकते हैं. इस तकनीक के बाद से न्यूनतम शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के साथ किया जा सकता है, यह भी poss जा सकता हैपदार्थ जो vivo में जीन की अभिव्यक्ति बदल इंजेक्षन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के लिए ible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

जानवरों पर प्रयोग guidlines और विनियमन देखभाल और पशु प्रयोगशाला के उपयोग करें (एनआईएच प्रकाशन सं 86-23, 1985 संशोधित) के लिए गाइड में उल्लिखित के अनुसार और मैरीलैंड जानवर की देखभाल के विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया और समिति का प्रयोग करें.

Acknowledgments

मैं एंथोनी टेलर vivo intracellular रिकॉर्डिंग और intracellular धुंधला तकनीक के प्रारंभिक विकास के साथ मदद के लिए ब्राउन और दाऊद मैक्सवेल में प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए धन्यवाद. मैं एम. रजत collocalization मैक्रो के साथ मदद के लिए धन्यवाद. किसके साथ कई विद्वानों मैं इस तकनीक के विकास सहित, एम. आर. डोंगा Moritani, पी. लुओ, आर Ambalavanar में अंतर्दृष्टि प्रदान की सहयोग किया है. एनआईएच DE10132 अनुदान, DE15386 और RR017971 से काफी समर्थन के साथ इस तकनीक को विकसित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
electromagnetic vibrator Ling Dynamic Systems V101
signal generator Feedback Systems PFG605 capable of producing trapezoidal output signal
electrode glass Sutter Instrument Co. AF100-68-10 with filament
electrode puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 or P-80
biotinamide Vector Laboratories SP-1120 stored at 4°C
Texas Red avidin DCS Vector Laboratories A-2016
tetramethlyrhodamine Molecular Probes, Life Technologies D-3308 3000 molecular weight, lysine fixable
mouse anti-synaptophysin antibody Chemicon International MAB5258
fluorescent Nissl stain Neurotrace, Life Technologies N-21480
electrode tester Winston Electronics BL-1000-B to measure electrode impedance
electrometer Axon Instruments Axoprobe 1A, Axoclamp 2B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
  2. Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
  3. Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
  4. Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
  5. Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
  6. Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
  7. Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
  8. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
  9. Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
  10. Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
  11. Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
  12. Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान 50 अंक Neurophysiology संवेदी न्यूरॉन मोटर नियंत्रण proprioception neurotransmitter है ज्ञानेन्द्रिय एकीकरण चूहा
शारीरिक, आंदोलन द्वारा संग्राहक न्यूरॉन्स के morphological और neurochemical विशेषता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dessem, D. Physiological,More

Dessem, D. Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement. J. Vis. Exp. (50), e2650, doi:10.3791/2650 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter