Summary
פיתחנו מטריצה ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.
Abstract
רקמת הריאה, כולל סרטן ריאות ומחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, במצטבר חשבון עבור חלק 280,000 מקרי מוות בשנה, מחלת ריאות חסימתית כרונית היא כיום הגורם המוביל הרביעי של מוות בארצות הברית 1. תרומה תמותה זה היא העובדה כי הריאות אינן בדרך כלל לתקן או לחדש מעבר לרמה, מיקרוסקופיים הסלולר. לכן, רקמת הריאה כי הוא נפגע על ידי ניוון או דלקת, או רקמת הריאה היא כריתה כירורגית אינו מוחלף תפקודית in vivo. כדי לחקור האם רקמת הריאה יכול להיות שנוצר במבחנה, התייחסנו הריאות מפני חולדות הבוגרת באמצעות הליך זה מסיר רכיבים סלולריים לייצר acellular תאי ריאה מטריצה הפיגום. פיגום זו שומרת על מבנים הסתעפות ההיררכי של דרכי הנשימה כלי הדם, כמו גם קרום מרתף שלם ברובו, המהווה קולגן IV, laminin ו פיברונקטין. הפיגום הוא רכוב bioreactor שנועד לחקות היבטים קריטיים של ריאה פיזיולוגיה, כגון אוורור בלחץ שלילי זלוף וסקולרית pulsatile. על ידי אפיתל culturing ריאתי האנדותל בכלי הדם בתוך הפיגום bioreactor רכוב, אנו מסוגלים לייצר רקמת הריאה כי ניתן להשוות phenotypically אל רקמת הריאה מקומיים כי הוא מסוגל להשתתף בחילופי גז מרווחי זמן קצר (45-120 דקות). תוצאות אלו מעודדות, וסבורים כי Repopulation של הריאות מטריצה היא אסטרטגיה מעשית עבור התחדשות ריאות. אפשרות זו מהווה הזדמנות לא רק לפעול למען הגדלת ההיצע של רקמת הריאות להשתלה, אלא גם ללמוד התא הנשימה ביולוגיה מולקולרית במבחנה לפרקי זמן ארוכים יותר ב microenvironment מדויק יותר מאשר היה אפשרי בעבר.
Protocol
1. Bioreactor האסיפה
דמות מפורט (ים) של העיצוב bioreactor והרכבה עבור decellularization והן בתרבות ניתנים איורים 1 ו -2, בהתאמה. כל הרכיבים חייבים להיות מעוקרים לפני הרכבה של bioreactor. נקודות ספציפיות הבאים ציין:
קשרים:
- צינורית עורקי מורכב מתאים luer נעילת המחובר-Y ספליטר על ידי קטע קצר של צינורות. מחבר luer נעילת מחוברת בצינור זלוף, ואת הקטע של Y שאינו sutured אל עורק הריאה מחוברת שסתום חד כיווני. שסתום חד כיווני מכוונת כך ניתן להסיק נוזל לתוך הצינור (בכיוון ההפוך כמו זלוף), אך במהלך זלוף איבר בינוני כל זורם לתוך הריאות.
- צינורית לקנה הנשימה גם מורכב מחבר luer נעילת מקושר ל-Y ספליטר עם צינורות. Luer נעילת מתחבר לולאה נשימה בין המאגר קנה הנשימה לבין תא הראשי. קטע של מחבר ה-Y שאינו sutured לקנה הנשימה קשורה גם שסתום חד כיווני. שסתום חד כיווני מכוונת באופן זהה צינורית העורקים.
פונקציות:
- חד כיווני שסתומים cannulae העורקים קנה הנשימה מנוצלים כדי לנקות בועות אוויר בצינור, בכך שהיא מאפשרת היפוך של הזרימה בצינור, ולכן התרת בועות אוויר כדי להסירו.
- "לולאה נשימה" כולל שני שסתומים חד כיווניים, כגון מיקומו בינוני העוקב בדרך שונה לתוך ומתוך הריאות. תיאור מפורט יותר של תכונה זו היא סיפקה בפרסום מראש 2 במעבדה שלנו.
- זלוף דם ניתנת באמצעות משאבה הרים. בינוני הוא perfused לתוך עורק הריאה באמצעות צינורית המחוברת, זורם vasculature הריאה, ומתוך הווריד הריאתי ישירות bioreactor הראשי, שם הוא בינוני משוכות עבור זלוף.
2. קציר איברים
- להרדים הבוגרת (06/03 בן חודש) פישר 344 חולדות על ידי יתר נתרן pentobarbital, בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (60 מ"ג / ק"ג IP). הערה: הפתרון pentobarbital כולל הפרין ב 100 יחידות / מ"ל עבור קרישה.
- תרסיס או למחוק את החזה & הבטן עם אתנול 70%.
- פתח את חלל בית החזה, חושפת את הלב והריאות, נזהר שלא לגרום נזק לריאות. בזהירות לעשות חלון קטן דרך הסרעפת לחלל בית החזה, הריאות גורמת לחזור בו, ולאחר מכן להרחיב את החתך בצורה אופקית כדי לחשוף את הבסיסים של הריאות. בצע שני חתכים אנכית דרך הצלעות, ו לחזור לכלוב החזה כדי לחשוף את הלב והריאות.
- הכן מערכת זלוף הכבידה, כלומר באמצעות מזרק עם הבוכנה הוסר, שסתום 3-way, ו ~ 20 ס"מ של צינורות עם מחט 1.5inch 21-מד,. שמור את המזרק ב ~ 20 ס"מ מעל החיה שימוש לעמוד טבעת. ודא שכל האוויר יוסר הצינור זלוף.
- חותכים את אטריום הזכות ניקוז הדם, למנוע ממנו לחזור אל הריאות. חיתוך אטריום שמאל כדי לאפשר ניקוז קל של דם perfusate מהריאות יכול להיות גם מועיל, אך לא הכרחי.
- הכנס את המחט לתוך הבסיס של החדר הימני, לפתוח את הברז כדי perfuse לריאות עם תמיסה של nitroprusside הפרין ונתרן (50U/ml ו 1ug/ml, בהתאמה) ב-PBS. ודא עורק הריאה מתמלא נוזל זלוף, ודם זה ניקוי מהריאות. במידת הצורך, למלא את המזרק עם טפטוף נוזלים נוספים. בדרך כלל רק 10 מ"ל ~ נדרשת.
- המשך טפטוף עד הריאות ברורים של דם, ואז להפסיק זלוף.
- מנתחים את קנה הנשימה חופשית, לתוך הצוואר במידת האפשר. ודא קנה הנשימה מופרד הוושט. לנתח את כל החיבורים הנותרים אל הלב, הריאות קנה הנשימה, ולהסיר את הגוש en.
- בעזרת מספריים או סכין המנתחים חדה, לחתוך את שיאו של הלב, לחשוף את החדרים על ימין ועל שמאל.
- Cannulate את תא המטען ריאתי דרך החדר הימני, תפר במקום. הסר את כל עודפי רקמה החדר השמאלי.
- Cannulate קנה הנשימה תפר במקום. ודא כי הן את קנה הנשימה ואת cannulae עורקי ריאתי ממוקמים כך שאין מתח torsional על קנה הנשימה, הריאות, או כלי גדול (איור 1).
- ודא שאין בועות אוויר בתוך הצינורית העורקים, מאז בועות אוויר שנלכדו במערכת עשויים למנוע זרם בלתי פוסק של דרך האיבר. במקרים מסוימים, בועת אוויר יכולה לעצור לחלוטין flow.To נוזל להשיג זאת, המקום הגוש לב / ריאה לצנצנת המכילה PBS. השתמש מזרק עם מחט להזריק כמות קטנה של PBS לתוך צינורית הלב לגרש כל הבועות.
- שטיפה דרכי הנשימה עם PBS 4-5 פעמים, כדי להסיר את האוויר ככל האפשר מן הריאה.
- לאחר שלב שטיפהים שלמים, לנפח את הריאות עם PBS nitroprusside המכיל נתרן (SNP) בשעה 1ug/ml. שים פקק על צינורית לקנה הנשימה, ולכן הפתרון נשארת בריאה. אפשר הריאות כדי לדגור עד 30 דקות, כמו הפתרון אותו זורם דרך כלי הדם דרך עורק הריאה, על מנת לאפשר התרחבות.
- חבר הלב / הריאות כובע bioreactor באמצעות luer נעילת קשרים קשור cannulae בצורת האות V, תיאר "העצרת bioreactor" לעיל. (איור 1).
3. איברים Decellularization
- חבר את המכסה (עם הריאות המצורפת) למנגנון decellularization (איור 1). צינורית עורק הריאה צריך להתחבר לקו זלוף, ואת צינורית לקנה הנשימה צריכה לצוף חופשי. ודאו כי כל הקווים ברורים של אוויר. כפי שתואר לעיל, האוויר הקווים יכולים להיות מקור של decellularization עניים על ידי מניעת זרימת נוזל decllularization. אוויר לכוד בתוך המערכת יכולה להימשך גם לתוך זמן תרבות, כאשר היא עשויה להיות השפעה שלילית על הישרדות התא 3.
- לנפח את הריאות עם PBS / SNP עד שהריאות מלאות, אך לא יתר מנופח. מיד כובע צינורית לקנה הנשימה של הריאות, כך נשאר מנופח.
- Perfuse ריאות עם PBS / SNP דקות לפחות ב 15 ~ 15 מ"מ כספית (20 ס"מ H 2 O הלחץ). לאחר 15 דקות או יותר, להסיר את הפקק של צינורית לקנה הנשימה על מנת לאפשר הריאות להוציא את האוויר.
- המשך זלוף עם PBS / SNP עבור 30 דקות. אם יש צורך, מלוי PBS / SNP כדי להבטיח לחץ זלוף נשמר 10-15 מ"מ כספית.
- בגין זלוף עם פתרון decellularization (בחורים 8mm, NaCl 1M, 25mm EDTA ב 1X PBS). תשמרי על מנת להבטיח את כל הקווים ברורים של אוויר. שואב אבק עשוי להיות מועיל כדי לספק יניקה.
Perfuse עם פתרון decellularization עד 500ml של פתרון יש perfused דרך הריאות. הלחץ הוא אופטימלי <15 מ"מ כספית (~ 20 ס"מ H 2 O). זה בדרך כלל ידרוש 2.5 שעות. ספיקות בדרך כלל איטי מאוד (0.2-0.5ml/minute) בתחילה, במהירות להגדיל במהלך השעה השנייה של כ 1ml/minute או יותר. מעת לעת, להסיר את נוזל decellularization בשימוש מ bioreactor, הבטחת נוזל נשאר מספיק כדי לתמוך ריאות צינורית לקנה הנשימה.
4. איברים שטיפה עיקור
- העברת ריאות bioreactor כדי ברדס בתרבית רקמה. בגין שטיפה עם PBS סטרילי על ידי הסרת 500ml צנצנת שהכילה את נוזל decellularization והחלפת עם צנצנת סטרילית המכילה עד 1 ליטר של PBS סטרילית. השתמש יניקה ואקום כדי להבטיח קווים ברורים של אוויר.
- Perfuse PBS דרך vasculature ב 10-15 מ"מ כספית, באופן זהה עבור decellularization. מעת לעת, להסיר הפסולת מן PBS bioreactor ולהחליף ו / או למלא את הצנצנת עם PBS טריים, PBS סטרילית. מומלץ להשתמש בטכניקה סטרילית.
- המשך שטיפת עד לפחות 2.5 ליטר של סטרילית PBS יש perfused הריאה.
- העברת ריאות למערכת חדשה, bioreactor סטרילי המכיל PBS טריים. ודא כי הן את הלולאה זלוף כולו קווי דרכי הנשימה כולה הן מלאות בנוזל. כל הצעדים הבאים ישתמשו משאבה pulsatile כדי perfuse הריאות בבית 5ml/min.
- לעקר את הפיגום, או דרך זלוף לילה עם PBS + 10% פתרון FBS עט סטרפטוקוקוס + 10% או במשך 3 שעות עם חומצה peracetic 0.1% ב-PBS. זה האחרון ידרוש שטיפת ריאות עם 3 שינויים של 250 מ"ל PBS על כמה שעות כדי להסיר שאריות חומצה. עבור כל אחד לשטוף, הריאות צריך להיות מאוורר כמו גם perfused על מנת להבטיח כי כל חלקי הרקמה הם השטיפה.
- מעבירים את הריאות עד 37 ° C החממה perfuse עם PBS כי יש 10% ו -10% FBS פניצילין / סטרפטומיצין עבור ~ 1 שעות או עד הטמפרטורה היא equilibrated, כהכנה לטיפול benzonase.
- פנקו את הריאות עם benzonase להסיר DNA שריד:
- חם החיץ benzonase (ראו טבלה של ריאגנטים) עד 37 ° C.
- לכל ריאה, למלא 10 מ"ל במזרק אחד עם חיץ benzonase רק אחד מזרק 10 מ"ל עם benzonase 90U/ml במאגר.
- עצור זלוף של הריאה.
- לנפח את דרכי הנשימה עם חיץ benzonase.
- אפשר הריאות להוציא את האוויר (דקה 1 ~). ואז, לנפח את הריאות עם פתרון benzonase. במהלך האינפלציה עם חיץ benzonase & benzonase, מנסים להימנע מכל הזרקת אוויר לתוך הריאות.
- אפשר הריאה לשבת ללא זלוף או אוורור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 אחרי ניפוח עם benzonase.
- קורות חיים זלוף עם PBS + 10% FBS, 10% פניצילין / סטרפטומיצין שכבר נמצא bioreactor, ולהמשיך לילה. למחרת, הריאות יכול להיות מאוחסן על 4 ° C (עד 3 חודשים) או לקראת זריעת התא.
- כדי להכין את הפיגום עבור ואכלוס הסלולר, להחליף את PBS / FBS / פתרון benzonase עם ~ 250 מ"ל של מדיום תרבות. Perfuse לפחות שעה אחת לפני תאים מוצגים,nd להחליף עם המדיום תרבות טריים ישירות לפני זריעת התאים.
5. Recellularization
הבחירה של מקור התא הזריעה המחודשת איבר שנותר עד חוקרים בודדים. מקורות תאים רבים יכול להיות מנוצל, כולל אוכלוסיות זמינים מסחרית, מבודדים תאים טרי ריאתי בילוד או העובר, בתאי גזע עובריים, תאים או מקורות זמינים מסחרית. פרוטוקולים ספציפיים עבור בידוד אוכלוסיות תאים אלה ניתן למצוא במקום אחר 4,5,6. כאן, אנו מספקים הוראות כיצד זרע הן אוכלוסיות תאים האנדותל אפיתל.
האנדותל זריעת:
- הכן ההשעיה של האוכלוסייה הרצוי תא האנדותל, בינוני התרבות המתאימה. תא ההשעיה סינון דרך מסננת תא 40um להסיר גושים התא. זריעת אנדותל אופייני במעבדה שלנו היה לנצל כ 30,000,000 ריאות חולדה לתאי אנדותל כלי הדם ב 60ml של המדיום לתרבות.
- לוותר על ההשעיה התא לתוך מאגר קטן משולבים באופן זמני לתוך הלולאה של זלוף bioreactor (איור 2). ודא צינורות מן המאגר הזה את הלולאה זלוף כולו ברור של בועות אוויר.
- להשרות תאים לתוך עורק הריאה בבית 3ml/min באמצעות משאבת הרים.
- לאחר עירוי תאים, להמשיך עם זלוף בינוני ממוחזר מבית bioreactor הראשי בקצב הרצוי.
- על בסיס יומי, להבטיח כי צינורות טפטוף ברור של בועות אוויר.
- בינוני יש להחליף בינוני טריים באופן קבוע, זה נעשה לעתים קרובות מדי 3-4 ימים.
אפיתל זריעת:
- הכן ההשעיה תא האוכלוסייה הרצוי תא אפיתל. במעבדה שלנו, זו בדרך כלל כוללת של כ 5-10 תאים עכברוש ריאתי בילוד. סנן את האוכלוסייה דרך מסננת תא 40um ו להשעות ב 15 מ"ל של מדיום תרבות מזרק. מלאו את מאגר דרכי הנשימה עם 80ml של המדיום לתרבות.
- מניחים את bioreactor ב 37 ° C רקמה תרבות חממה, ולחבר את משאבת מזרק לאוורור. ודאו כי כל הקווים אוורור ברורים של אוויר.
- Seed את התאים לתוך הריאות על ידי הזרקת 15 מ"ל של השעיה תא כמו בולוס אחד לתוך צינורית לקנה הנשימה.
- מיד להתחיל בנשימה אחת, איטית באמצעות משאבת מזרק. נשימה זו מנוהלת על ידי נסיגה 60ml של אוויר bioreactor הראשי בבית 3ml/minute, וכך נמשך כ 20 דקות. ודא מסנני אוויר על bioreactor העיקריים הם כתרים מיד לאחר הזרקת ההשעיה התא לפני תחילת נשימה איטית.
- אפשר הריאות לשבת סטטי כ 18hrs, ולאחר מכן להתחיל זלוף כלי הדם איטית (כ 0.5 mL / min).
6. איברים תרבות
למרות הפרטים של זלוף ואוורור תשתנה בהתאם עיצוב ניסיוני, הנקודות הבאות ציין:
- במהלך התרבות אנדותל, זלוף מבוצע בדרך כלל 1-3 דקות מ"ל / באמצעות משאבת הרים. במהלך התרבות אפיתל, אוורור ניתנת בדרך כלל בקצב רציף של נשימה 1 לדקה באמצעות משאבת מזרק. נסיגה של 10 מ"ל-5 של אוויר bioreactor הראשי נדרש בדרך כלל השפעה אוורור הריאות בהיקף גאות נורמלי. בשל הצורך לשמור על אטום bioreactor במהלך אוורור, אוורור צריכה להיות עצר יומי ואת האוויר בחדר העיקרי צריך להיות החליפו. כל האוויר המערכת לאוויר החדר, המהווה כ 21% חמצן בלחץ חלקי. הנסיגה 5-10 מ"ל של אוויר bioreactor (אשר מעוררת השראה 5-10 מ"ל של נוזל על ידי הריאות) מבוסס על גודל הריאות וכיצד האונות רבים נמצאים בתרבית (האונות ניתן לקשור את לניתוח, ואילו האונות הנותרים להמשיך בתרבות). כמות האוויר מסוגר על ידי משאבת מזרק נבחר המשוער של "נפח גאות" של הריאה תרבותי.
- בינוני יש לשנות בערך כל 3-4 ימים במהלך התרבות.
- במהלך התרבות המשותפת של האפיתל וגם האנדותל, ניסויים זרע המעבדה הראשונה שלנו בדרך כלל אפיתל ימים 4-8, במהלכן רקמות מהונדסות מאוורר. האנדותל הוא seeded אז דרך זלוף, לאחר רקמה היא גם perfused ומאוורר.
7. נציג תוצאות:
Decellularization
כאשר פרוטוקול מבוצע כראוי, את הריאות חילוץ טרי צריך להחזיק באוויר ללא דולף. גידול מלאכותי אותם עם האוויר תוך שקוע בתוך נוזל יכול לבדוק את זה - לא צריכה להיות שום בועות המצביעים על דליפות אוויר. Decellularization הבאים צריך לאפשר ~ 500ml של נוזל decellularization לזרום דרך הריאות במשך 2.5-3 שעות ב 37 ° C, ו-PBS, בסופו של דבר צריכים להיות מסוגלים לזרום דרך הריאות בערך 10 מ"ל / דקה (תחת ~ 15 מ"מ כספית של הלחץ ההידרוסטטי) בסוף השטיפה. לאחר הטיפול בחומצה peracetic 0.1% ו benzonase, הריאות יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים, ועדיין להישאר מתאים recellularization.
המטריצה הסופית decellularized תאיים צריך להיות נטול לחלוטין של חומרים הסלולר, ולשמר את המאפיינים ברוטו, מיקרוסקופיים ultrastructural של הריאה הילידים. Decellularization מספיק או שטיפה עלולה לגרום שריד DNA "דבק" אל הגרדום, אשר ניתן דמיינו עם hematoxylin סטנדרטיים eosin כתם (ראה איור 3 לצורך השוואה).
Repopulation של מטריקס acellular והתרבות של רקמת הריאות
אם תאים מבודדים טרי מ 7 הישן יום גורים עכברוש בילוד, כמתואר במוסף מקוון המלווה את העבודה על ידי פטרסון ועמיתיו 4, אפשר לצפות תשואה התא של 120-150 מיליוני תאים בכל המלטה של 10 גורים (רק מעל 10 מיליון התאים לכל רך נולד).
תנאים אופטימליים זריעת תא ותרבות הבאות של הריאות ב bioreactor אמור להניב היטב מופץ תאים בתוך כל 5 האונות של הריאה, ויש לספק כיסוי של כ -70% של תאי המטריצה הפיגום (איור 3). אוכלוסיית תאים בתרבית תהיה חיובית עבור מפתח סמנים תא הנשימה כגון הפרשה הפרו חלבון C (SPC), הפרשה קלרה תא חלבון (CCSP), וכן אקווה פורין-5 (AQP), על מנת השפע היחסי (איור 4).
באיור 1. Cannulae עמדות bioreactor decellularization
איור 2. Bioreactor המשמש זריעת והתרבות של רקמת הריאה מהונדסים
איור 3. היסטולוגיה של הילידים, decellularized ו אוכלס מחדש ריאות
איור 4. מכתים immunofluorescence עבור סמנים ריאות מפתח
Discussion
ההיבטים הקריטיים ביותר של המערכת המוצגת כאן כוללת תחזוקה של עקרות, ומעקב קרוב לחצי להחיל המיטה כלי דם לאורך כל התהליך של הכנת זריעת הפיגום ו culturing הריאה אוכלס מחדש. עקרות מתוחזק על ידי מיטב מעוקר כל החומרים לפני השימוש, על ידי הרכבה הריאה במערכת סגורה זמן קצר לאחר explant והימנעות הפרה שלאחר מכן המכשול הזה. אחרי מטריקס decellularized כבר השטיפה והועברו bioreactor סטרילית לתרבות, כובע סיליקון חותמות אחרות קשרים לא צריך להיות מופרע או להסירו. כדי לשמור על הלחצים לבדוק, תזרים מונע על ידי כוח הכבידה עדיפה במידת האפשר. כאשר המשאבה נדרש recirculation של נוזל, החל לאחר שטיפה עם PBS והמשך במהלך התרבות, אנו ממליצים ישירות מדידת הלחץ לפני נוזל מזין את עורק הריאה עם מתמר הלחץ. עוצמת הלחץ המופעל לא יעלה על 15 מ"מ כספית.
הריאות Recellularized יכול להיות מתורבת לפרקי זמן, בדרך כלל החל 4 ימים עד 3 שבועות. זלוף דם מושגת בדרך כלל 1-3 דקות מ"ל / במהלך התרבות האנדותל, תוך אוורור מיושם בדרך כלל במהלך התרבות אפיתל בקצב נשימה 1 / min. בתקופות תרבות משולב, אוורור זלוף בו זמנית מתאים. אוורור יכול להתבצע עם בינוני או נוזל או אוויר.
במהלך העשורים האחרונים, כמה קבוצות עשו עבודה הנדסת רקמות חשוב להראות את הכדאיות של הבחנה אפיתל הריאות במבחנה של שכפול כמה היבטים של הריאות microanatomy 7,8,9, 10. עם זאת, עד לאחרונה, אף 4,5 אלה ניסיונות מהנדס רקמת הריאה הניבו איבר להשתלה כי הצליחה לשמור על הפרדה בין הדם לתאים בדרכי הנשימה וזה יכול להשתתף חילוף הגזים. לכן, אם כי השיטות שתוארו הן רק צעד ראשון לקראת המטרה ארוכת הטווח של יצירת רקמת הריאה פונקציונלי, עבודה זו היא צעד מעודד לקראת אפשרות של הגדלת כמות רקמת הריאה זמינים להשתלה. יתר על כן, עבודה זו מרחיב העבודה שנעשתה על ידי אוט et al. ו Uygun ועמיתיו 11,12, הוכחת היעילות של מטריצה תאיים decellularized כמו פיגום להנדסת רקמות תלת ממדי מבנים מורכבים ותמיכה הצמיחה וההישרדות של סוגים שונים של תאים . עבודה זו היא משמעותית גם עבור תרומתה בארסנל של התא הנשימה ביולוגים מולקולריים. על ידי מתן ייחודי, תלת מימדי סביבה יכול גם לספק גירוי מכני מתאים, וזה לא לשתף את הסיכון הנלווה של בידול דה מהיר כי אחד עשוי להיתקל בהן בעת מכרסם culturing אפיתל במעבדה עם שיטות מסורתיות יותר 13, מדענים יכולים להשתמש המערכת שלנו כדי לקבל תובנה חדשה אינטראקציות תא תא ותא-matrix כי תפקיד התמיינות תאים ותפקוד. ידע זה עשוי להיות חזק במיוחד אם משתמשים בו כמנוף להנחות את גורלו של אוכלוסיות תאים שונות גזע, כקבוצה של Cortiella הוכיחה במחקרים הראשונית 14.
Disclosures
LEN מחזיק המניות Humacyte, חברה רפואה רגנרטיבית. Humacyte לא קרן המחקרים הללו, וגם לא השפיע על עיצוב, פרשנות, או דיווח של כל הניסויים או בשיטות המתוארות. המחברים (LEN, THP, EAC) ואת אוניברסיטת ייל הגישו בקשה לפטנט הקשורים להנדסת רקמות של הריאות.
Acknowledgments
אנו מודים Maegan ב Colehour לעזרה בפיתוח bioreactor. מחקרים אלו מומנו על ידי אוניברסיטת ייל מחלקת הרדמה ועל ידי NIH מענק HL 098,220 (כדי LEN). THP נתמך על ידי NIH T32 GM007171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthanasia | |||
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Sodium nitroprusside | Fluka | 71778 | |
| Euthasol euthanasia solution | Virbac Animal Health | 710101 | 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration |
| Decell Solution | |||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | |
| NaCl | American Bioanalytical | AB01915 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-01 | |
| 1X PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Bioreactor Components | |||
| 480 ml jar | Cole-Parmer | EW-3460560 | |
| Silicone stopper, size 14 | Cole-Parmer | EW-06298-26 | |
| Y-connectors | Cole-Parmer | ED-30614-08 | Used for arterial and tracheal cannulae |
| Silicone tubing | Masterflex (Cole Palmer) | 96420-14; 16 | L/S 14; 16 |
| Pressure Transducers | Edwards Lifesciences | PX-212 | |
| Check valve | Cole-Parmer | EW-98553-20 | One-way valve |
| 4-way stopcocks | Edwards Lifesciences | 594WSC | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 2915-08 | PTFE, 0.2μm |
| Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor) | |||
| 500 and 1000 ml glass bottles | Corning | 1395-500; -1L | Used for decell and rinsing by gravity |
| Benzonase Treatment | |||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043 | 1M, pH 8.0 |
| MgCl2 | JT Baker | 2444-01 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix |
References
- American Lung Association. Lung Disease Data. , (2008).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
- Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
- Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
- Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
- Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
- Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
- Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
- Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).
- Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
- Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).
