Summary
O uso de suínos domésticos e em miniatura na ciência tem aumentado significativamente nos últimos anos. Ao demonstrar como executar a intubação, cateterismo vesical transuretral, artéria femoral e cateterização da veia, bem como a perfusão transcardial, pretendemos aumentar ainda mais o valor de Göttingen minipigs na pesquisa biomédica.
Abstract
O surgimento do minipig Göttingen na pesquisa de temas como a neurociência, toxicologia, diabetes, obesidade e cirurgia experimental reflete a estreita semelhança destes animais à anatomia e fisiologia humana 1-6. O tamanho da minipig Göttingen permite o uso de cirurgia equipamentos e avançados métodos de imagem semelhantes aos usados em humanos 6-8. O objetivo deste vídeo-aula é aumentar a consciência sobre o valor dos porquinhos na pesquisa biomédica, demonstrando como executar a intubação traqueal, cateterismo vesical transuretral, artéria femoral e cateterização da veia, bem como a perfusão transcardial.
Intubação endotraqueal deve ser realizada sempre que um minipig sofre anestesia geral, porque mantém uma via aérea patente, permite ventilação assistida e protege as vias aéreas dos aspirados. Cateterismo vesical transuretral pode fornecer informações úteis sobre sobre o estado de hidratação, bem como função renal e cardiovascular durante longos procedimentos cirúrgicos. Além disso, cateterismo urinário podem evitar a contaminação de equipamentos médico-técnica delicada e extensão da bexiga dolorosa que pode prejudicar o animal e desnecessariamente influência do experimento devido ao aumento do tônus vagal e alteração nos parâmetros fisiológicos. Cateterização arterial e venosa é útil para a obtenção de amostras de sangue repetidas e monitoramento de vários parâmetros fisiológicos. Cateterização de vasos femorais é preferível a cateterização dos vasos do pescoço para maior facilidade de acesso, quando a realização de experimentos envolvendo frame-based neurocirurgia estereotáxica e imagiologia cerebral. Ao realizar o cateterismo navio em estudos de sobrevida, técnica asséptica rigorosa deve ser empregada para evitar infecções 6. Perfusão Transcardial é o método de fixação mais eficaz, e produz resultados de destaque na elaboração de órgãos minipig para histologia e histoquímica 2,9. Para mais informações sobre a cirurgia anestesia e técnicas experimentais em suínos, em geral nos referimos a Swindle 2007. Informações suplementares sobre a pré-medicação e indução da anestesia, ventilação assistida, analgesia, cuidados pré e pós-operatório de Göttingen porquinhos estão disponíveis através da Internet em http://www.minipigs.com 10. Para informações completas sobre anatomia suína nos referimos a Nickel et al. Vol. 01-05 novembro.
Protocol
1. Intubação
- Equipamentos necessários para entubação endotraqueal: meios de ventilação assistida, fundas para a abertura da boca, sucção de baixa pressão com a ponta sem corte, laringoscópio com lâmina reta veterinária entre 17 e 25 cm de comprimento, estilete, seringa com ar, estetoscópio e fita adesiva. Para adultos Göttingen minipigs um tamanho de tubo endotraqueal 5-7 mm é apropriada 10. Neste vídeo um tubo de 5,5 mm foi utilizada 10.
- O minipig é colocado em suas costas e devidamente comprovadas, a fim de garantir que a passagem da laringe é mantido em linha reta.
- A língua é um pouco puxado para fora e da mandíbula mantidas abertas por um assistente, sem uso abusivo da cabeça. Rotação das vias aéreas ou a extensão excessiva da cabeça pode obstruir as vias aéreas, tornando a abertura da laringe mais difícil identificar e complicando a colocação do tubo traqueal.
- O laringoscópio é passado para a cavidade faríngea e usados para deprimir a língua, fazendo com que a epiglote visíveis. A ponta da sucção é utilizada para deslocar a epiglote do palato mole. A ponta do laringoscópio é então usado para pressionar a epiglote para cima em direção a base da língua, revelando a abertura da laringe.
- As cartilagens aritenóides e pregas vocais entram em vista e do tubo endotraqueal é avançada suavemente com uma ligeira rotação, na traquéia durante a expiração.
- O manguito do tubo é inflado de acordo com as especificações de fabricação tendo o cuidado de evitar a inflação em excesso, o que pode causar inchaço e edema das vias aéreas. Os porcos têm um brônquio para ventilar o lobo cranial direito pulmonal. Portanto, é importante para colocar o tubo acima da bifurcação da traquéia. Isto é facilitado usando o tamanho correto do tubo e mais importante, pela fixação da extremidade proximal do tubo ao nível do focinho com fita adesiva.
- Quando o minipig está devidamente entubado, uma passagem livre de ar deve ser sentida através do tubo, e ausculta pulmonar deve revelar sons de respiração em ambos os lados esquerdo e direito do tórax.
- Depois de ligar o ventilador com sistema de monitoramento para o minipig, fisiológicos valores de dióxido de carbono expiratório devem ser mensuráveis e da curva de dióxido de carbono que segue o padrão de respiração decidiu pela ajustes do ventilador 6,10 podem ser observados.
- O dióxido de carbono e os valores da oximetria pode inicialmente ser afetada pela pré-medicação e indução anestésica. No entanto, estes valores devem reverter rapidamente volta ao normal com ventilação adequada 6,10. Qualquer sinal de cianose apesar artificial assistida ventilação indicam colocação imprópria do tubo. O erro mais comum é a colocação inadvertida do tubo no esôfago.
2. Cateterismo vesical transuretral
- Este procedimento é apenas para fêmeas. Para minipigs adulto tamanho do cateter Foley francês 8 ou 10 é apropriado. Devido à curvatura e tamanho da abertura uretral externo, um cateter com estilete é preferível. Um espéculo nasal pode ser usado em pequenos porquinhos enquanto um espéculo com lâminas mais pode ser útil para grandes animais. Equipamento necessário também inclui uma ponta romba-fórceps, uma seringa com lubrificante, solução salina e um sistema fechado de bolsa de drenagem de urina.
- A fim de melhor visualizar o orifício externo da uretra durante o cateterismo é o minipig colocados em suas costas com um apoio sob a região lombar, enquanto um assistente puxa as patas traseiras cranialmente.
- O espéculo lubrificado é inserido e abriu para visualizar a parede vaginal. A abertura externa feminina uretral está localizado no piso da vagina cerca de um terço à metade da distância até o colo do útero (Fig. 1A). No entanto, porque o animal é colocado na parte traseira, a posição da abertura uretral aparecerá para ser invertido.
- O cateter é controlada com a pinça romba-ponta, para que a ponta do cateter está na continuação do fórceps. Insira cuidadosamente o cateter na abertura da uretra (Figura 1B). A uretra é facilmente traumatizada se a força é muito usado durante o cateterismo. Contudo, a resistência ligeira pode inicialmente ser sentidas até o cateter passou o esfíncter urinário externo. Se o problema persistir, isso pode indicar que o animal não está sedado profundamente o suficiente. A solução é esperar um pouco e deixar a anestesia tomar o seu efeito.
- Como o cateter alcança a bexiga, remova o estilete, e urina será visto fluindo.
- Inflar o balão com solução salina de acordo com as especificações do fabrico e puxe o cateter até que o balão pega no colo da bexiga.
- Anexar o sistema fechado bolsa de drenagem de urina.
- Cateter a fita para a cauda para evitar deslocamento acidental do cateter ao manusear o animal.
3. Artéria femoral e veia catheterization
- Equipamento necessário inclui: bisturi, sem corte de ponta tesoura cirúrgica, pinça, pequenas blunt-ponta pinça cirúrgica, afastador de tecidos pequena auto-retenção, porta-agulhas, swaps cirúrgica, sutura com agulha, soro fisiológico heparinizado como um flush-fluido para manter a permeabilidade do cateter , dois de calibre 18 cânula IV, dois 4-Francês bainhas ponta brite com introdutor e arame Seldinger guia.
- A profundidade da anestesia deve ser avaliado pelo teste do reflexo interdigital dor antes de iniciar o procedimento.
- A artéria femoral e da veia são abordados com o minipig colocados em suas costas ea perna traseira retraído lateralmente. Identificar na prega de pele entre o músculo grácil e sartório, onde a pulsação da parte superficial da artéria safena medial desaparece.
- Faça uma incisão cutânea longitudinal superficial cranial a este ponto, evitando assim, inadvertidamente, danificar os vasos medial safena.
- Use uma tesoura de ponta romba para dissecar o tecido subcutâneo subjacente.
- A divisão da fáscia do músculo sartório e grácil é dividido cranial ao local de penetração dos vasos safena medial, primeiro com uma pequena blunt-ponta pinça cirúrgica e depois digitalmente.
- Os dois grupos musculares são separadas com afastador de tecidos pequena auto-retenção tendo o cuidado para não danificar o nervo femoral e vasos.
- A artéria é isolado por um período de aproximadamente 1 a 2 cm, utilizando dissecção romba.
- Gire a agulha venflon chanfrada para o lúmen é voltado para cima. Dobrar a agulha um pouco por isso vai acompanhar a curvatura navio com mais facilidade. Lembre-se de garantir a agulha ainda pode ir e vir com pouco esforço.
- A artéria é puncionada, a agulha retraída eo fio-guia Seldinger é inserido através do tubo venflon.
- Retire o tubo venflon enquanto suavemente aplicando pressão na artéria para assegurar a fixação do fio-guia.
- A bainha com introdutor é inserida sobre o fio Seldinger e avançado para a posição desejada, após o qual o introdutor e arame Seldinger é removido.
- A veia femoral está localizado logo abaixo e medial à artéria. Após isolar a veia utilizando dissecção romba, a veia é canulada, como descrito anteriormente para a artéria.
- Para verificar que tanto a artéria e veia cateterizada são corretamente, tirar sangue de ambas as bainhas e comparar a cor das amostras. Sempre que desenho uma amostra de sangue, lembre-se de seguida lavar os cateteres com solução salina heparinizada, a fim de manter a permeabilidade do cateter.
- Os cateteres são garantidos ea pele é fechada com alguns pontos.
- Um ciclo de navio pode ser colocado ao redor da artéria e veia, a fim de fixar os vasos antes da punção. Apesar de suas vantagens, geralmente evitar este passo adicional, porque requer dissecção excessiva dos vasos e pode aumentar o risco de danificar os ramos laterais e profundas.
4. Perfusão Transcardial
- Os seguintes equipamentos são necessários para o procedimento: sistema de perfusão (Fig. 2), fluidos de perfusão relevantes, bisturi, sem corte de ponta de uma tesoura cirúrgica, tesoura de osso, e duas grandes auto-holding pinças dos quais pelo menos um tem uma ponta curva. A auto-retenção afastador esternal não é absolutamente necessário, mas facilita o processo consideravelmente.
- Perfusão Transcardial deve ser realizada em um quarto bem ventilado com um alto sistema de extracção de fumos e poder instalações que permitem a coleta de líquidos e sangue do perfusato para a eliminação segura subseqüentes.
- Após injeção intravenosa de uma dose letal de pentobarbital, teste do reflexo interdigital dor antes de continuar.
- O melhor acesso para o coração e aorta é fornecido através de uma esternotomia mediana. Faça uma incisão longitudinal de pele profunda, que se estende desde o manúbrio ao processo xifóide do esterno. Ter acesso à cavidade torácica, fazendo uma pequena incisão no diafragma, logo abaixo do apêndice xifóide.
- Inserir as tesouras óssea para a cavidade torácica e bisect do esterno. Cuidados devem ser tomados ao realizar este procedimento, porque o coração pode ser aderente em algum lugar para o interior do esterno. Portanto, certifique-se que a lâmina da tesoura osso repousa em todos os tempos no interior da cavidade torácica contra o interior do esterno.
- Após o esterno foi dividido, coloque o afastador auto-retenção do esterno e abrir a cavidade torácica.
- Se ainda intacto, fazer uma pequena incisão no pericárdio no ápice do coração e, em seguida, digitalmente abrir o saco pericárdico.
- Identificar o ventrículo esquerdo, aurícula direita ea aorta, juntamente com a veia cava superior (Fig. 1C)
- Faça um pequeno corte superficial perto do ápice do coração e de acesso ao ventrículo esquerdo por perfuração do miocárdio com um instrumento de ponta romba.
- Insira o perfusion cânula no interior do ventrículo esquerdo e mova a ponta da cânula cranialmente para a aorta.
- Quando a cânula é sentida entre os dedos na aorta, fixar a cânula no lugar com a pinça auto-holding curvas.
- Faça uma incisão na aurícula direita e começar a injetar o fixador através da cânula de perfusão. O fluxo de perfusato na aorta pode ser sentida, e sangue derramará através da aurícula direita incisão como o fluxo de perfusato para os vasos minipig continua. Observe como a perfusão sistêmica com paraformaldeído induz hiperextensão dos membros e espasmos da musculatura superficial, devido à aldeído ligação transversal dos nervos e músculos. Ao utilizar um sistema de perfusão alimentado por ar comprimido em vez da gravidade, certifique-se remover a cânula, ou prender o tubo de silicone claro, antes do canister está vazio, a fim de evitar a entrada de ar no sistema vascular.
Figura 1. A: A fêmea Göttingen minipig abertura uretral externo B:. A abertura da uretra após a inserção de cateter C:. Vista ventral do coração minipig após a esternotomia mediana.
Figura 2. R: O sistema de perfusão consiste de tubo de entrada com uma válvula de pressão ajustável e uma alavanca usada para controle de admissão de ar comprimido dentro do recipiente mantendo o perfusato. Tubo de silicone claro liga o recipiente para uma cânula de ponta romba feita a partir de um tubo de aço 4 milímetros B e C:. Ao comprimir a alavanca de entrada, a pressão sobe no recipiente e do perfusato é propelido através da cânula D:. Quando a clara tubo de silicone e cânulas são preenchidos com perfusato, o fluxo é interrompido com uma pinça eo sistema está pronto para uso.
Discussion
Esta apresentação fornece instruções passo-a-passo as instruções visuais sobre como realizar quatro procedimentos freqüentemente utilizados na pesquisa minipig 12,13. As técnicas descritas podem ser utilizados com pouca ou nenhuma adaptação em suínos da raça Landrace e outros animais de pesquisa de grande porte como cães e ovelhas 14. A técnica asséptica deve ser empregada para evitar infecções, ao executar os procedimentos descritos em estudos de sobrevida.
Indução da anestesia é importante para o bem-estar animal e as razões científicas, e deve fornecer ausência de reflexos da córnea e relaxamento muscular bom, antes da intubação traqueal é tentada. No entanto, porque os anestésicos usados para a indução não são dadas em doses fixas, mas administrado até o efeito desejado é observado, é importante acompanhar de perto o animal, devido ao risco de apnéia, especialmente se estiver usando propofol 6,10. Para a intubação traqueal, o uso de xilocaína spray ou relaxante muscular pode facilitar a introdução do tubo, mas o uso de bloqueadores neuromusculares deve ser feito apenas por pessoal que são bem treinados em tais procedimentos, de modo a estar em conformidade com os requisitos éticos. Cuidados devem ser tomados para não traumatizar a passagem da laringe durante a intubação, a fim de evitar o inchaço da traquéia e edema. Edema das vias aéreas pode ser tratada com AINE ou similar anti-inflamatórios 10. Os porcos podem ser entubados de várias posições, mas com o animal em sua parte traseira tende a ser mais fácil para aqueles que regularmente realizar intubação humano, pois apresenta as vias aéreas de forma semelhante 6. O erro mais comum durante a intubação é a colocação inadvertida do tubo no esôfago, que está situado logo abaixo da laringe a passagem quando o animal é colocado em suas costas. Note, o tubo não deve nunca ser avançados sem primeiro identificar claramente as cartilagens aritenóides e pregas vocais.
Cateterização transuretral da bexiga através da uretra é facilmente feito em suínos fêmeas, enquanto que este procedimento é extremamente difícil, talvez impossível, no sexo masculino 6. Deve-se notar que, desde o orifício da uretra feminina é anterior à vagina, a maior abertura vaginal pode ser erroneamente cateterizada. O uso de lubrificante estéril e desinfecção é aconselhável para estudos de sobrevida. Além disso, lubrificante com efeito anestésico local pode facilitar o procedimento de cateterismo.
Ao realizar artéria femoral e veia catherization, a escolha de cateteres navio e como eles são garantidos diferem entre a sobrevivência não e estudos de sobrevivência, especialmente quando os cateteres são implantados por um período prolongado de tempo 6. Por exemplo, cateteres para implantação crônica deve ser altamente biocompatível, tem contas a retenção ou punhos para fixação, bem como não traumatizar a parede do vaso ao longo do tempo, induzindo a trombose ou erosão 6.
No vídeo presente, nós usamos um sistema fechado alimentado por ar comprimido para perfusão transcardial. Outra opção é usar um sistema orientado pela gravidade. A vantagem dos sistemas de gravidade em comparação com sistemas que utilizam ar comprimido é que eles são simples, eficientes e não apresentam risco de ar pressurizado entrar no sistema vascular. No entanto, a pressão hidrostática exercida pela gravidade sistemas muda continuamente durante a perfusão, e isso pode afetar os resultados histológicos 15. Dependendo de qual tipo de estudos histopatológicos se quer executar, pode ser vantajoso para perfundir o animal com solução salina heparinizada primeiro. Este é importantance especial ao realizar a coloração de imunofluorescência, a fim de evitar problemas causados por autofluorescência eritrócitos. Além disso, se o órgão de interesse é o cérebro, a aorta descendente poderia ser fixada para salvar fixador. No entanto, em suínos, este passo implica adicionais dissecação e irá prolongar o procedimento.
Disclosures
Todos os procedimentos foram aprovados pelo dinamarquês Experimental animal Inspecção do Ministério da Justiça dinamarquês e foram conduzidos de acordo com os "Princípios de cuidados com animais de laboratório" (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985).
Acknowledgments
O estudo foi apoiado financeiramente pela Fundação Lundbeck, The Karen Elise Jensen Foundation, O Fundo de Pesquisa em Saúde da Região Central da Dinamarca e do Instituto de Medicina Clínica Aarhus University Hospital. Reconhecemos com gratidão a ajuda hábil de Donald F Smith, Steen Anders Soerensen, Soerensen Henrik, Asbjoern Ettrup-Christensen, e os funcionários da Paaskehoejgaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation | |||
| Respirator | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| Suction with blunt tip | Unomedical | 34091181 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 (Laryngoscope set) | |
| Endotracheal tube 5.5 mm ID | Smiths Medical | 100/199/055 | |
| Stylet | Hudson RCI | 5-151001 | |
| Syringe 5ml | |||
| Stethoscope | Martin | 17-262-00 | |
| Bladder catherization | |||
| AquaFlate glycerine silicone Foley catheter 8-French with stylet | Rüsch | 178003 | |
| Speculum nasal | Martin | 36-859-50 | |
| Speculum rectal | Martin | 30-613-15 | |
| Blunt-tip forceps | Martin | 13-374-16 | |
| Catheter lubricant gel | |||
| Cathejell Lidocain | Montavit | CJL08501 | |
| Instillagel Comb. | Falcon BD | 08-40-200 | |
| A4 Urine drainage bag | Unomedical | 38 155 1S | |
| Adhesive tape | |||
| Femoral artery and vein catherization | |||
| Scalpel | Martin | 10-295-11 | |
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Tissue forceps | Martin | 12-100-14 | |
| Small blunt-tip surgical forceps | Martin | 13-375-13 | |
| Small self-retaining Tissue retractor | Martin | 15-753-13 | |
| Needleholder | Martin | 20-634-14 | |
| Surgical swaps | |||
| Suture with needle | |||
| Saline | |||
| Heparine | Leo Laboratories | 585679 | |
| 18-gauge venflon | BD Biosciences | 393206 | |
| 4-French brite tip sheaths with introducer and Seldinger guide wire | Cordis | 154-2629-1/0017 | |
| Transcardial perfusion | |||
| Pressurized perfusion system | Home made | ||
| Fume extraction system | Gram A/S | 01750000 and 0303700 | |
| Perfusant 5L | |||
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Bone shears | F.S.T. | 16150-24 | |
| Large curved tip self-holding forceps | Martin | 13-421-18 | |
| Self retaining sternal retractor | Rudolf Medical | 7520-10 | |
| Pentobarbital | The Royal Veterinary and Agricultural University (KVL) | 200 mg/ml | |
| 22-gauge venflon | BD Biosciences | 393202 | |
References
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