Summary
L'utilisation de porcs domestiques et les miniatures dans la science a considérablement augmenté ces dernières années. En démontrant comment effectuer une intubation, cathétérisme vésical transurétrale, l'artère fémorale et cathétérisme de la veine, ainsi que la perfusion transcardial, nous visons à accroître davantage la valeur de miniporcs Göttingen en recherche biomédicale.
Abstract
L'émergence de l'miniporc Göttingen dans la recherche de sujets tels que la neuroscience, de la toxicologie, le diabète, l'obésité et la chirurgie expérimentale reflète l'étroite ressemblance de ces animaux à l'anatomie et la physiologie humaines 1-6. La taille de la miniporc Göttingen permet l'utilisation des instruments chirurgicaux modalités d'imagerie des équipements et avancées similaires à celles utilisées chez l'homme 6-8. Le but de cette vidéo pédagogique est d'augmenter la sensibilisation sur la valeur de miniporcs dans la recherche biomédicale, en démontrant comment effectuer une intubation trachéale, cathétérisme vésical transurétrale, l'artère fémorale et cathétérisme de la veine, ainsi que la perfusion transcardial.
L'intubation endotrachéale doit être effectuée chaque fois qu'un miniporc subit une anesthésie générale, car elle maintient une perméabilité des voies respiratoires, permet une ventilation assistée et protège les voies respiratoires d'aspiration. Cathétérisme vésical transurétrale peuvent fournir des informations utiles sur l'état d'hydratation sujet ainsi que la fonction rénale et cardiovasculaire pendant de longues procédures chirurgicales. Par ailleurs, le cathétérisme urinaire peut empêcher la contamination de délicates médico-technique des équipements et l'extension vessie douloureuse qui peut nuire à l'animal et inutilement l'influence de l'expérience en raison de tonus vagal augmenté et modifié les paramètres physiologiques. Cathétérisme artériel et veineux est utile pour obtenir des échantillons de sang répétées et la surveillance de divers paramètres physiologiques. Cathétérisme des vaisseaux fémoraux est préférable à un cathétérisme des vaisseaux du cou pour faciliter l'accès, lors de la réalisation des expériences impliquant basée sur des trames neurochirurgie stéréotaxique et l'imagerie cérébrale. Lorsque vous effectuez un cathétérisme navire dans les études de survie, une stricte asepsie doivent être respectées pour éviter les infections 6. Perfusion Transcardial est la méthode de fixation le plus efficace, et donne des résultats prééminent lors de la préparation des organes miniporc pour l'histologie et histochimie 2,9. Pour plus d'informations sur l'anesthésie, la chirurgie et les techniques expérimentales chez le porc en général, nous nous référons à Swindle 2007. Informations supplémentaires sur une prémédication et l'induction de l'anesthésie, la ventilation assistée, l'analgésie, les soins pré-et postopératoire des miniporcs Göttingen sont disponibles via Internet à l'adresse http://www.minipigs.com 10. Pour des informations détaillées sur l'anatomie porcine nous nous référons à Nickel et al. Vol. 1 au 5 novembre.
Protocol
1. L'intubation
- Equipement nécessaire pour l'intubation endotrachéale: des moyens de ventilation assistée, élingues pour l'ouverture de la bouche, l'aspiration à basse pression avec la pointe émoussée, laryngoscope à lame droite vétérinaires entre 17 et 25 cm de long, stylet, une seringue avec de l'air, un stéthoscope et le ruban adhésif. Pour les adultes Göttingen miniporcs une taille de sonde endotrachéale 5 à 7 mm est approprié 10. Dans cette vidéo, un tube de 5,5 mm a été utilisée 10.
- Le porc miniature est placée sur son dos et correctement soutenue afin d'assurer que le passage du larynx est bien droit.
- La langue est sorti légèrement et la mâchoire maintenue ouverte par un assistant, sans étendre démesurément la tête. Rotation des voies respiratoires ou la prolongation excessive de la tête peut obstruer les voies respiratoires, rendant l'ouverture du larynx plus difficiles à identifier et à compliquer la position endotrachéale du tube.
- Le laryngoscope est passé dans la cavité du pharynx et utilisé pour abaisser la langue, faisant de l'épiglotte visibles. La pointe de l'aspiration est utilisé pour déplacer l'épiglotte du palais mou. La pointe du laryngoscope est alors utilisé pour appuyer sur l'épiglotte vers le haut vers la base de la langue, révélant l'ouverture du larynx.
- Les cartilages aryténoïdes et des cordes vocales entrent en vue et le tube endotrachéal est avancé doucement avec une légère rotation, dans la trachée pendant l'expiration.
- Le ballonnet du tube est gonflé selon les spécifications de fabrication tout en prenant soin d'éviter l'inflation excessive, qui peut provoquer un gonflement et un œdème des voies respiratoires. Les porcs ont une bronche pour ventiler le droit du lobe crânienne pulmonal. Il est donc important de placer le tube au-dessus de la bifurcation trachéale. Ceci est facilité par l'utilisation de la taille du tube correct et surtout par l'accrochage de l'extrémité proximale du tube au niveau du museau à l'aide de ruban adhésif.
- Lorsque le cobaye est correctement intubé, un passage libre de l'air doit être ressenti par le tube, et l'auscultation du thorax devrait révéler les sons de respiration à la fois dans le côté gauche et droite du thorax.
- Après la connexion du ventilateur avec le système de surveillance pour le cobaye, physiologiques expiratoire maximal des valeurs de dioxyde de carbone devraient être mesurables et la courbe de dioxyde de carbone qui suit le modèle de respiration décidé par le réglages du ventilateur 6,10 peuvent être observés.
- Le dioxyde de carbone et des valeurs d'oxymétrie peut d'abord être affectés par la prémédication et l'induction anesthésique. Cependant, ces valeurs devraient revenir rapidement à la normale avec une bonne ventilation 6,10. Tout signe de cyanose, malgré artificielle assistée de ventilation indiquent un mauvais positionnement du tube. L'erreur la plus courante est le placement involontaire du tube dans l'œsophage.
2. Cathétérisme vésical transurétrale
- Cette procédure est uniquement pour les porcs femelles. Pour miniporcs adulte une taille de sonde de Foley française 8 ou 10 est approprié. En raison de la courbure et la taille de l'ouverture externe de l'urètre, un cathéter avec le stylet est préférable. Un spéculum nasal peut être utilisé dans de petites miniporcs alors un spéculum avec lames plus longues peuvent être utiles pour les grands animaux. L'équipement nécessaire comprend également une pointe émoussée pince-, une seringue avec une solution saline, du lubrifiant et un sac de système fermé d'urine de drainage.
- Afin de mieux visualiser l'orifice urétral externe pendant un cathétérisme le cobaye est placé sur son dos avec un soutien en vertu de la région lombaire, pendant qu'un assistant tire les pattes postérieures céphalique.
- Le spéculum lubrifié est inséré et ouvert à visualiser la paroi vaginale. La femelle l'ouverture urétral externe est situé dans le plancher du vagin environ un tiers à la moitié de la distance sur le col (Fig. 1A). Cependant, parce que l'animal est placé sur le dos, la position de l'ouverture de l'urètre sera semblent être inversé.
- Le cathéter est contrôlé avec la pince émoussée-tip, donc l'extrémité du cathéter est dans la continuation de la pince. Insérez soigneusement le cathéter dans l'urètre (Fig. 1B). L'urètre est facilement traumatisés si trop de force est utilisée pendant un cathétérisme. Toutefois, une légère résistance peut d'abord se faire sentir avant le cathéter a passé le sphincter urinaire externe. Si ce problème persiste, cela peut indiquer que l'animal n'est pas assez profondément sous sédation. La solution est d'attendre un peu et de laisser l'anesthésie de prendre son effet.
- Comme le cathéter atteint la vessie, retirer le stylet, et d'urine seront vus couler.
- Gonflez le ballon avec une solution saline, conformément aux spécifications de la fabrication et tirez doucement le cathéter jusqu'à ce que le ballon rentre dans le col de la vessie.
- Fixez le sac en système clos de drainage d'urine.
- Tape le cathéter à la queue pour éviter le déplacement accidentel de la sonde lors de la manipulation de l'animal.
3. L'artère fémorale et la veine catheterization
- L'équipement nécessaire comprend: scalpel, émoussée pointe des ciseaux chirurgicaux, des forceps de tissu, de petites pointes émoussées pinces chirurgicales, petite écarteur auto-maintien, porte-aiguilles, des swaps chirurgicaux, suture avec aiguille, solution saline héparinée comme un ras-fluide pour maintenir la perméabilité du cathéter , deux de calibre 18 IV canule, deux 4-française gaines pointe brite avec introducteur et de guide-fil de Seldinger.
- La profondeur de l'anesthésie doivent être évalués en testant les réflexes douleurs interdigitaux avant d'entamer la procédure.
- L'artère et la veine fémorales sont abordées avec le cobaye placé sur son dos et la jambe arrière rétracté latéralement. Identifier dans le pli de peau entre le muscle gracile et couturier, où la pulsation de la partie superficielle de l'artère saphène médial disparaît.
- Faire une incision cutanée longitudinale superficielle crânienne à ce point, évitant ainsi d'endommager les vaisseaux inadvertance médial saphène.
- Utiliser une pointe de ciseaux émoussés pour disséquer le tissu sous-cutané.
- La division aponévrose du muscle couturier et gracile est divisé crânienne sur le site de pénétration des vaisseaux médial saphène, d'abord avec une petite pointe émoussée-pinces chirurgicales et ensuite numériquement.
- Les deux groupes de muscles sont séparés par un écarteur auto-statique petits tout en prenant soin de ne pas endommager le nerf fémoral et des vaisseaux.
- L'artère est isolée pour une longueur d'environ 1 à 2 cm en utilisant une dissection.
- Tournez l'aiguille Venflon biseauté de sorte que le lumen est orientée vers le haut. Plier l'aiguille un peu donc il va suivre la courbure des navires plus facilement. N'oubliez pas de vérifier que l'aiguille ne peut toujours aller et venir avec peu d'effort.
- L'artère est percée, l'aiguille rétracté et le fil-guide de Seldinger est insérée dans le tube Venflon.
- Retirer le tube Venflon tout en douceur en appliquant une pression sur l'artère afin d'assurer la fixation du fil guide.
- La gaine avec introducteur est inséré sur le fil de Seldinger et avancé à la position souhaitée, après quoi l'introducteur et le fil de Seldinger est enlevé.
- La veine fémorale est situé juste en dessous et en dedans de l'artère. Après avoir isolé la veine à l'aide dissection, la veine est canulée comme décrit précédemment pour l'artère.
- Pour vérifier que les artères et veines sont correctement cathétérisés, prélever du sang de deux gaines et de comparer la couleur des échantillons. Chaque fois que le dessin d'un échantillon de sang, n'oubliez pas de rincer ensuite avec une solution saline les cathéters héparinés afin de maintenir la perméabilité du cathéter.
- Les cathéters sont sécurisés et la peau est fermée avec quelques points de suture.
- Une boucle de navire peut être placée autour de l'artère et la veine, afin de fixer les vaisseaux avant la ponction. Malgré ses avantages, nous avons généralement d'éviter cette étape supplémentaire, car elle nécessite une dissection plus de vaisseaux et peut augmenter le risque d'endommager les branches latérales et en profondeur.
4. Perfusion Transcardial
- Le matériel suivant est nécessaire pour la procédure: le système de perfusion (Fig. 2), les liquides de perfusion pertinents, un scalpel, émoussé pointe des ciseaux chirurgicaux, ciseaux os, et deux grandes auto-maintien d'une pince dont au moins un a une pointe recourbée. Une auto en conservant écarteur sternal n'est pas absolument nécessaire, mais elle facilite considérablement la procédure.
- Perfusion Transcardial doit être effectuée dans une pièce bien aérée avec un système d'extraction des fumées à haute puissance et des équipements qui permettent la collecte de liquides perfusat et de sang pour l'élimination sans danger ultérieur.
- Après injection intraveineuse d'une dose létale de pentobarbital, le test du réflexe de la douleur interdigitaux avant de continuer.
- Le meilleur accès vers le cœur et l'aorte est fourni via une sternotomie médiane. Faire une incision cutanée longitudinale profonde, s'étendant de la manubrium au processus xiphoïde du sternum. Accéder à la cavité thoracique en faisant une petite incision dans le diaphragme juste en dessous de la pointe du sternum.
- Insérez la cisaille osseuse dans la cavité thoracique et coupent le sternum. Des précautions doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure, parce que le cœur peut être adhérent à un certain endroit à l'intérieur du sternum. Par conséquent, assurez-vous que la lame de la cisaille os repose en tout temps dans la cavité thoracique, contre l'intérieur du sternum.
- Après le sternum a été divisé, mis dans le écarteur autostatique sternale et ouvrir la cavité thoracique.
- Si encore intacte, faire une petite incision dans le péricarde à la pointe du cœur et ensuite numériquement ouvrir le sac péricardique.
- Identifier le ventricule gauche, l'oreillette droite et l'aorte avec la veine cave supérieure (Fig. 1C)
- Faire une petite entaille superficielle près de la pointe du cœur et de l'accès du ventricule gauche par perforation du myocarde avec un instrument contondant pointe.
- Insérez le perfusions canule à l'intérieur du ventricule gauche et déplacer les extrémité de la canule dans l'aorte céphalique.
- Lorsque la canule se fait sentir entre les doigts de l'aorte, pince la canule en place avec la pince à auto-maintien incurvé.
- Faire une incision dans l'oreillette droite et commencer le fixateur injection à travers la canule de perfusion. Le flux de perfusat dans l'aorte peut se faire sentir, et le sang versera à travers l'oreillette droite incisées que le débit du perfusat dans les vaisseaux miniporc continue. Remarquez comment perfusion systémique avec du paraformaldéhyde induit une hyperextension des membres et des spasmes de la musculature superficielle due à l'aldéhyde-réticulation des nerfs et des muscles. Lorsque vous utilisez un système de perfusion alimentée par l'air comprimé au lieu de la pesanteur, assurez-vous d'enlever la canule, ou serrer le tube de silicone clair, avant que la cartouche est vide, afin d'éviter l'air de pénétrer dans le système vasculaire.
Figure 1. R: La femelle Göttingen miniporc ouverture urétral externe. B: L'ouverture urétrale après l'insertion d'un cathéter C:. Vue ventrale du cœur miniporc après sternotomie médiane.
Figure 2. R: Le système de perfusion se compose de tubes en entrée avec une valve de pression réglable et d'un levier utilisé pour contrôler l'entrée d'air comprimé dans le récipient contenant le liquide de perfusion. Tube en silicone clair relie le récipient à une canule émoussée pointe faite d'un tuyau de 4 mm d'acier B et C:. En compressant le levier d'entrée, la pression monte dans le conteneur et le perfusat est propulsé à travers la canule D:. Lorsque le clair tube en silicone et la canule sont remplis de liquide de perfusion, l'écoulement est arrêté avec une pince et le système est prêt à l'emploi.
Discussion
Cette présentation fournit, étape par étape les instructions visuelles sur la façon d'effectuer quatre procédures fréquemment utilisés dans la recherche miniporc 12,13. Les techniques décrites peuvent être utilisées avec peu ou aucune adaptation chez les porcs Landrace et autres animaux de recherche importants tels que les chiens et les moutons 14. Une technique aseptique doit être utilisée pour éviter les infections, lorsqu'il accomplit les procédures décrites dans les études de survie.
L'induction de l'anesthésie est important pour le bien-être animal et des raisons scientifiques, et devrait fournir l'absence de réflexes cornéens et une bonne relaxation musculaire, avant l'intubation endotrachéale est tentée. Cependant, parce que les anesthésiques utilisés pour l'induction ne sont pas donnés à doses fixes, mais administré jusqu'à l'effet désiré est observé, il est important de surveiller de près l'animal en raison du risque d'apnée, surtout si vous utilisez le propofol 6,10. Pour l'intubation trachéale, l'utilisation de spray xylocaïne ou un relaxant musculaire peut faciliter l'introduction du tube, mais l'utilisation de bloqueurs neuromusculaires ne doit être effectué par du personnel qui sont bien formés à ces procédures afin de se conformer aux règles d'éthique. Il faut prendre soin de ne pas traumatiser le passage du larynx pendant l'intubation, afin d'éviter un gonflement de la trachée et l'oedème. Oedème des voies respiratoires peut être traitée avec des AINS ou similaire anti-inflammatoires 10. Les porcs peuvent être intubé à partir de positions différentes, mais ayant l'animal sur son dos a tendance à être plus facile pour ceux qui effectuent régulièrement l'intubation humaine, car elle présente les voies respiratoires de façon similaire 6. L'erreur la plus commune pendant l'intubation est le placement involontaire du tube dans l'œsophage, qui est situé juste en dessous du passage du larynx lorsque l'animal est placé sur le dos. Remarque, le tube ne doit jamais être avancé sans avoir d'abord identifier clairement les cartilages aryténoïdes et des cordes vocales.
Cathétérisme transurétrale de la vessie par l'urètre se fait facilement chez les porcs femelles, alors que cette procédure est extrêmement difficile, voire impossible, chez les hommes 6. Il faut noter que depuis l'orifice urétral féminine est antérieure du vagin, la plus grande ouverture vaginale peut être tort cathétérisés. L'utilisation de lubrifiant stérile et de désinfection est conseillé pour les études de survie. Par ailleurs, lubrifiant avec effet anesthésique local peut faciliter la procédure de cathétérisme.
Lorsque vous effectuez l'artère fémorale et cathétérisme veine, le choix de cathéters navire et comment ils sont sécurisés diffèrent entre la non-survie et les études de survie, surtout lorsque les cathéters sont implantés pour une période de temps prolongée 6. Pour les cathéters par exemple pour l'implantation chronique devraient être hautement biocompatible, des perles de rétention ou les poignets pour fixation ainsi que ne pas traumatiser la paroi des vaisseaux avec le temps, induisant ainsi une thrombose ou d'érosion 6.
Dans la vidéo, nous utilisons un système fermé alimenté par l'air comprimé pour perfusion transcardial. Une autre option est d'utiliser un système piloté par la gravité. L'avantage des systèmes de gravité par rapport aux systèmes utilisant l'air comprimé est qu'ils sont simples, efficaces et ne présentent aucun risque d'air sous pression dans le système vasculaire. Cependant, la pression hydrostatique exercée par les systèmes de gravité change continuellement durant la perfusion, et cela peut affecter les résultats histologiques 15. Selon le type d'études histopathologiques l'on veut réaliser, il peut être avantageux pour perfuser l'animal avec une solution saline héparinée premier. C'est notamment lors de l'exécution importantance coloration par immunofluorescence afin d'éviter les problèmes causés par autofluorescence érythrocytes. Par ailleurs, si l'organe d'intérêt est le cerveau, l'aorte descendante pourrait être serrée pour sauver fixateur. Cependant, chez les porcs, cette étape implique la dissection supplémentaires et prolonger la procédure.
Disclosures
Toutes les procédures ont été approuvées par l'Agence danoise des animaux d'expérimentation Inspection, Ministère danois de la Justice et ont été menées conformément aux "Principes de soins des animaux de laboratoire» (NIH Publication No. 86-23, révisée en 1985).
Acknowledgments
L'étude a été soutenue financièrement par la Fondation Lundbeck, les Karen Jensen Fondation Elise, Le Fonds de recherche en santé du Danemark Région Centrale et de l'Institut de Médecine clinique Aarhus University Hospital. Nous reconnaissons avec gratitude l'aide habile de Donald F Smith, Anders Steen Soerensen, Henrik Soerensen, Asbjoern Ettrup-Christensen, et le personnel de Paaskehoejgaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation | |||
| Respirator | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| Suction with blunt tip | Unomedical | 34091181 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 (Laryngoscope set) | |
| Endotracheal tube 5.5 mm ID | Smiths Medical | 100/199/055 | |
| Stylet | Hudson RCI | 5-151001 | |
| Syringe 5ml | |||
| Stethoscope | Martin | 17-262-00 | |
| Bladder catherization | |||
| AquaFlate glycerine silicone Foley catheter 8-French with stylet | Rüsch | 178003 | |
| Speculum nasal | Martin | 36-859-50 | |
| Speculum rectal | Martin | 30-613-15 | |
| Blunt-tip forceps | Martin | 13-374-16 | |
| Catheter lubricant gel | |||
| Cathejell Lidocain | Montavit | CJL08501 | |
| Instillagel Comb. | Falcon BD | 08-40-200 | |
| A4 Urine drainage bag | Unomedical | 38 155 1S | |
| Adhesive tape | |||
| Femoral artery and vein catherization | |||
| Scalpel | Martin | 10-295-11 | |
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Tissue forceps | Martin | 12-100-14 | |
| Small blunt-tip surgical forceps | Martin | 13-375-13 | |
| Small self-retaining Tissue retractor | Martin | 15-753-13 | |
| Needleholder | Martin | 20-634-14 | |
| Surgical swaps | |||
| Suture with needle | |||
| Saline | |||
| Heparine | Leo Laboratories | 585679 | |
| 18-gauge venflon | BD Biosciences | 393206 | |
| 4-French brite tip sheaths with introducer and Seldinger guide wire | Cordis | 154-2629-1/0017 | |
| Transcardial perfusion | |||
| Pressurized perfusion system | Home made | ||
| Fume extraction system | Gram A/S | 01750000 and 0303700 | |
| Perfusant 5L | |||
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Bone shears | F.S.T. | 16150-24 | |
| Large curved tip self-holding forceps | Martin | 13-421-18 | |
| Self retaining sternal retractor | Rudolf Medical | 7520-10 | |
| Pentobarbital | The Royal Veterinary and Agricultural University (KVL) | 200 mg/ml | |
| 22-gauge venflon | BD Biosciences | 393202 | |
References
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