Summary
El uso de cerdos domésticos y en miniatura en la ciencia se ha incrementado significativamente en los últimos años. Mediante la demostración de cómo llevar a cabo la intubación, cateterización transuretral de la vejiga, la arteria femoral y cateterización de la vena, así como la perfusión transcardial, nuestro objetivo es aumentar aún más el valor de cerdos enanos Göttingen en la investigación biomédica.
Abstract
La aparición de la minipig Göttingen en la investigación de temas como la neurociencia, la toxicología, la diabetes, la obesidad y la cirugía experimental refleja la estrecha semejanza de estos animales a la anatomía y fisiología humana 1.6. El tamaño de la minipig Göttingen permite el uso de cirugía equipos y avanzadas técnicas de imagen similares a las utilizadas en humanos 6-8. El objetivo de este video instructivo es aumentar la conciencia sobre el valor de los enanos en la investigación biomédica, mediante la demostración de cómo realizar la intubación traqueal, la cateterización transuretral de la vejiga, la arteria femoral y cateterización de la vena, así como la perfusión transcardial.
La intubación endotraqueal se debe realizar cada vez que un minipig se somete a anestesia general, ya que mantiene una vía aérea permeable, permite la ventilación asistida y protege las vías respiratorias de los aspirados. Cateterismo transuretral de la vejiga puede proporcionar información útil sobre el estado de hidratación, así como sobre la función renal y cardiovascular durante procedimientos quirúrgicos largos. Además, el cateterismo urinario puede evitar la contaminación de los delicados equipos medico-técnico y la extensión de vejiga dolorosa que le puede hacer daño al animal e innecesariamente influir en el experimento debido a un aumento del tono vagal y la alteración de parámetros fisiológicos. Cateterización venosa y arterial es útil para la obtención de muestras repetidas de sangre y monitoreo de parámetros fisiológicos distintos. La cateterización de los vasos femorales es preferible a la cateterización de los vasos del cuello para facilitar el acceso, cuando se realizan experimentos con marco basado en neurocirugía estereotáxica y de imagen cerebral. Cuando se realiza un cateterismo buque en estudios de supervivencia, la técnica aséptica debe ser empleado para evitar infecciones 6. Perfusión Transcardial es el método de fijación más efectiva, y con resultados por excelencia en la preparación de los órganos minipig para histología e histoquímica 2,9. Para obtener más información acerca de la anestesia, la cirugía y las técnicas experimentales en cerdos, en general, nos referimos a la estafa de 2007. Información complementaria acerca de la premedicación y la inducción de la anestesia, ventilación asistida, analgesia, cuidado pre y postoperatorio de los cerdos enanos Göttingen están disponibles a través de Internet en http://www.minipigs.com 10. Para una amplia información sobre la anatomía porcina nos referimos al níquel et al. Vol. Noviembre 01 al 05.
Protocol
1. Intubación
- Equipo necesario para la intubación endotraqueal: los medios de ventilación asistida, eslingas para la apertura de la boca de succión de baja presión con punta roma, laringoscopio con hoja recta veterinaria entre 17 y 25 cm de largo, estilete, jeringa con aire, el estetoscopio y cinta adhesiva. Para adultos Göttingen minipigs un tamaño de tubo endotraqueal 5 a 7 mm es apropiado 10. En este video de un tubo de 5,5 mm se utilizan 10.
- El minipig se coloca en la espalda y con un buen apoyo con el fin de asegurar que el paso de la laringe se mantiene recta.
- La lengua se saca un poco la mandíbula y mantiene abierto por un asistente, sin extender demasiado la cabeza. La rotación de las vías respiratorias o la extensión excesiva de la cabeza puede ocluir las vías respiratorias, por lo que la apertura laríngea más difíciles de identificar y que complica la colocación del tubo traqueal.
- El laringoscopio se introduce en la cavidad faríngea y se utilizan para deprimir la lengua, haciendo visible la epiglotis. La punta de la succión se utiliza para desplazar la epiglotis del paladar blando. La punta del laringoscopio se utiliza para presionar la epiglotis hacia arriba, hacia la base de la lengua, que revela la apertura laríngea.
- Los cartílagos aritenoides y las cuerdas vocales salir a la luz y el tubo endotraqueal se avanza suavemente con una ligera rotación, en la tráquea durante la espiración.
- El manguito del tubo es inflado de acuerdo a las especificaciones de la fabricación, teniendo cuidado de evitar el exceso de inflación, que puede causar inflamación y edema de las vías respiratorias. Los cerdos tienen un bronquio para ventilar el lóbulo derecho pulmonal craneal. Por tanto, es importante colocar el tubo por encima de la bifurcación de la tráquea. Esto se facilita mediante el uso del tamaño del tubo correcto y lo más importante de la fijación del extremo proximal del tubo en el nivel de la boca con cinta adhesiva.
- Cuando el minipig está correctamente intubado, un paso libre de aire debe ser sentida a través del tubo, y la auscultación del pecho debe revelar los sonidos de respiración en el lado izquierdo y derecho del tórax.
- Al conectar el ventilador con sistema de monitoreo para la minipig, fisiológicos valores espiratoria de dióxido de carbono deben ser mensurables y la curva de dióxido de carbono que sigue el patrón de respiración decidido por los parámetros del ventilador 6,10 se pueden observar.
- El dióxido de carbono y los valores de oximetría inicialmente puede verse afectada por la premedicación y la inducción de la anestesia. Sin embargo, estos valores rápidamente en caso de volver a la normalidad con la ventilación adecuada 6,10. Cualquier signo de cianosis a pesar artificial asistida por ventilación indican colocación inadecuada del tubo. El error más común es la colocación accidental de la sonda en el esófago.
2. Cateterismo transuretral de la vejiga
- Este procedimiento es sólo para cerdas. Para cerdos enanos adultos de un tamaño sonda de Foley francés de 8 o 10 es el adecuado. Debido a la curvatura y el tamaño de la abertura uretral externo, un catéter con fiador es preferible. El tabique nasal se puede utilizar en cerdos pequeños, mientras que un espéculo, con hojas más largas pueden ser útiles para los animales grandes. Equipo necesario también incluye unas pinzas una punta roma, una jeringa con lubricante solución salina, y una bolsa de orina sistema cerrado de drenaje.
- Con el fin de visualizar mejor el orificio externo de la uretra durante la cateterización del minipig se coloca en la espalda con un soporte en la región lumbar, mientras que un ayudante saca las patas traseras craneal.
- El espéculo lubricado se inserta y se abrió para visualizar la pared vaginal. La abertura de la uretra femenina externa se encuentra en el piso de la vagina aproximadamente un tercio a la mitad de la distancia en el cuello uterino (Fig. 1A). Sin embargo, debido a que el animal se coloca en la parte posterior, la posición de la abertura de la uretra se parecen estar invertidos.
- El catéter se controla con las pinzas con puntas romas, de modo que la punta del catéter está en la continuación de las pinzas. Inserte cuidadosamente el catéter en el orificio de la uretra (Fig. 1B). La uretra es fácilmente traumatizados si la fuerza se utiliza demasiado durante el cateterismo. Sin embargo, una ligera resistencia al principio se puede sentir hasta que el catéter ha pasado el esfínter urinario externo. Si el problema persiste, esto puede indicar que el animal no está sedado profundamente. La solución es esperar un poco y dejar que la anestesia tener su efecto.
- A medida que el catéter llega a la vejiga, retire el estilete, y la orina se verá que fluye.
- Inflar el globo con una solución salina de acuerdo a las especificaciones de la fabricación y tire suavemente de la sonda hasta que el globo de las capturas en el cuello de la vejiga.
- Coloque la bolsa de orina en un sistema cerrado de drenaje.
- Tape el catéter a la cola para evitar el desplazamiento accidental del catéter al manipular el animal.
3. Arteria femoral y la vena catheterization
- El equipo necesario incluye: bisturí, con puntas romas tijeras quirúrgicas, pinzas de tejido, pequeñas puntas romas pinzas quirúrgicas, pequeñas auto-contención retractor de tejido, porta-agujas, swaps quirúrgicos, suturas con agujas, suero salino heparinizado como una descarga de fluidos para mantener la permeabilidad del catéter , dos de calibre 18 IV cánula, dos de 4 franceses vainas punta brite con introductor y el alambre de Seldinger guía.
- La profundidad de la anestesia debe ser evaluado por las pruebas del reflejo interdigital dolor antes de iniciar el procedimiento.
- La arteria femoral y la vena se acercó con la minipig colocado en la espalda y la pierna de atrás retraído lateralmente. Identificar en el pliegue de la piel entre el músculo recto interno y el sartorio, donde la pulsación de la parte superficial de la arteria safena medial desaparece.
- Haga una incisión longitudinal superficial de la piel del cráneo a este punto, evitando así inadvertidamente dañar los vasos safena medial.
- Utilice unas tijeras con puntas romas para diseccionar el tejido subcutáneo subyacente.
- La división de la fascia del músculo sartorio y recto interno del muslo se divide craneal al sitio de penetración de los vasos safena medial, primero con una pequeña pinza de puntas romas quirúrgico y luego digitalmente.
- Los dos grupos de músculos se separan con un retractor de tejido pequeño auto-contención, teniendo cuidado de no dañar el nervio femoral y los vasos.
- La arteria está aislado en una longitud de aproximadamente 1 a 2 cm utilizando disección roma.
- Gire la aguja venflon biselado para que la luz es hacia arriba. Doblar la aguja un poco por lo que siguen la curvatura barco con mayor facilidad. Recuerde que debe asegurarse la aguja puede moverse hacia atrás y hacia delante con poco esfuerzo.
- La arteria se pincha, la aguja se retractó y la guía de Seldinger se introduce a través del tubo venflon.
- Retire el tubo venflon mientras ejerciendo una suave presión en la arteria para asegurar la fijación de la guía.
- La vaina con introductor se inserta sobre el alambre de Seldinger y avanzó a la posición deseada, después de que el presentador y el alambre de Seldinger se retira.
- La vena femoral se encuentra justo debajo y medial a la arteria. Después de aislar la vena utilizando disección roma, la vena se cánula a lo descrito previamente para la arteria.
- Para verificar que tanto la arteria y la vena se cateteriza correctamente, extraer la sangre de los dos vainas y compare el color de las muestras. Cada vez que una muestra de sangre, recuerde lavar posteriormente los catéteres con solución salina heparinizada con el fin de mantener la permeabilidad del catéter.
- Los catéteres están asegurados y la piel se cierra con unas cuantas suturas.
- Un bucle recipiente puede ser colocado alrededor de la arteria y la vena con el fin de fijar los vasos antes de la punción. A pesar de sus ventajas, por lo general evitar este paso adicional, ya que requiere una disección excesiva de los vasos y puede aumentar el riesgo de dañar las ramas laterales y de profundidad.
4. Perfusión Transcardial
- El siguiente equipo es necesario para el procedimiento: sistema de perfusión (Fig. 2), los fluidos de perfusión relevantes, bisturí, con puntas romas tijeras quirúrgicas, tijeras de hueso, y la celebración de dos grandes auto-pinzas de los cuales al menos uno tiene una punta curvada. Un auto de retención retractor esternal no es absolutamente necesario, sino que alivia considerablemente el procedimiento.
- Transcardial perfusión se debe realizar en una habitación bien ventilada, con un sistema de extracción de humos de alta potencia y las instalaciones que permiten la recolección de líquidos perfundido y la sangre para la eliminación segura posteriores.
- Después de la inyección por vía intravenosa una dosis letal de pentobarbital, prueba del reflejo interdigital dolor antes de continuar.
- El mejor acceso al corazón y la aorta se realiza a través de una esternotomía media. Haga una incisión longitudinal profundas de la piel, se extiende desde el manubrio con el proceso xifoides del esternón. Acceder a la cavidad torácica, haciendo una pequeña incisión en el diafragma justo debajo de la apófisis xifoides.
- Introduzca las tijeras de hueso en la cavidad torácica y atraviesan el esternón. Se debe tener cuidado al realizar este procedimiento, porque el corazón puede estar adherido a algún lugar en el interior del esternón. Por lo tanto, asegúrese de que la hoja de las tijeras ósea se basa en todo momento dentro de la cavidad torácica en la parte interior del esternón.
- Después de que el esternón se ha dividido, puesto en el retractor auto retención del esternón y abrir la cavidad torácica.
- Si sigue intacta, hace una pequeña incisión en el pericardio en el ápice del corazón y luego digitalmente abrir el saco pericárdico.
- Identificar el ventrículo izquierdo, la aurícula derecha y la aorta con la vena cava superior (Fig. 1C)
- Hacer un pequeño corte superficial cerca del ápice del corazón y el acceso del ventrículo izquierdo por perforación del miocardio con un instrumento de punta roma.
- Inserte el perfusion cánula en el interior del ventrículo izquierdo y mover la punta de la cánula cranealmente hacia la aorta.
- Cuando la cánula se hace sentir entre los dedos en la aorta, la abrazadera de la cánula en su lugar con las pinzas curvas de auto-explotación.
- Hacer una incisión en la aurícula derecha y comenzar a inyectar el fijador a través de la cánula de perfusión. El flujo de perfusión de la aorta se puede sentir, y la sangre se derrama a través de la aurícula derecha una incisión en el flujo de perfusión en los vasos minipig continúa. Observe cómo la perfusión sistémica con paraformaldehído induce la hiperextensión de las extremidades y contracciones de la musculatura superficial debido a la aldehído entrecruzamiento de los nervios y los músculos. Cuando se utiliza un sistema de perfusión accionadas por aire comprimido en lugar de la gravedad, asegúrese de retirar la cánula, o sujetar el tubo de silicona transparente, antes de que el cartucho está vacío, con el fin de evitar la entrada de aire del sistema vascular.
Figura 1. R: La hembra Göttingen minipig orificio uretral externo. B: La apertura de la uretra después de la inserción del catéter C:. Vista ventral del corazón minipig después de esternotomía media.
Figura 2. R: El sistema de perfusión consiste en tubos de entrada con una válvula de presión ajustable y una palanca para controlar la entrada de aire comprimido en el contenedor de la perfusión. Tubos de silicona transparente conecta el recipiente de una cánula roma punta hecha de un tubo de 4 mm de acero B y C:. Mediante la compresión de la palanca de entrada, la presión aumenta en el contenedor y la perfusión es impulsado a través de la cánula D:. Cuando la clara tubo de silicona y la cánula se llenan de perfusión, el flujo se detiene con una abrazadera y el sistema está listo para su uso.
Discussion
Esta presentación proporciona instrucciones paso a paso las instrucciones visuales en la forma de realizar cuatro procedimientos utilizados en la investigación minipig 12,13. Las técnicas descritas pueden ser utilizadas con poca o ninguna adaptación en los cerdos Landrace y otros animales de investigación de gran tamaño como los perros y las ovejas 14. La técnica aséptica se deben emplear para evitar las infecciones, al realizar los procedimientos descritos en estudios de supervivencia.
Inducción de la anestesia es importante para el bienestar de los animales y las razones científicas, y debe proporcionar la ausencia de reflejos corneales y buena relajación muscular, antes de la intubación endotraqueal se intenta. Sin embargo, debido a los anestésicos utilizados para la inducción no se administran en dosis fijas, pero administradas hasta el efecto deseado se observa, es importante vigilar de cerca al animal, debido al riesgo de apnea del sueño, especialmente si se utiliza propofol 6,10. Para la intubación traqueal, el uso de spray de xilocaína o relajante muscular puede facilitar la introducción de la sonda, pero el uso de bloqueadores neuromusculares sólo debe ser realizado por personal bien entrenado en estos procedimientos de manera que cumpla con los requisitos éticos. Se debe tener cuidado de no traumatizar el paso laríngeo durante la intubación, para evitar la inflamación y el edema traqueal. Edema de vías aéreas pueden ser tratados con AINE o similares anti-inflamatorios no esteroideos 10. Los cerdos pueden ser intubados desde varias posiciones, pero que el animal en la espalda tiende a ser más fácil para aquellos que llevan a cabo regularmente la intubación humanos, ya que presenta la vía respiratoria de una manera similar 6. El error más común durante la intubación es la colocación accidental de la sonda en el esófago, que está situado justo debajo del paso de laringe cuando el animal se coloca en la espalda. Tenga en cuenta que el tubo no se debe avanzar sin identificación clara de los cartílagos aritenoides y las cuerdas vocales.
Cateterismo transuretral de la vejiga urinaria a través de la uretra se hace fácilmente en las cerdas, mientras que este procedimiento es extremadamente difícil, quizás imposible, en los hombres 6. Cabe señalar que desde el orificio de la uretra femenina es anterior a la vagina, la abertura más grande vaginal puede ser erróneamente sondaje. El uso de lubricante estéril y desinfección se recomienda para estudios de supervivencia. Además, el lubricante con efecto anestésico local puede facilitar el procedimiento de cateterización.
Al realizar la arteria femoral y cateterización venosa, la elección de los catéteres buque y la forma en que se fijan diferencias entre la supervivencia y no estudios de supervivencia, sobre todo cuando los catéteres son implantados por un período prolongado de tiempo 6. Por ejemplo, para la implantación de catéteres crónicos debe ser altamente biocompatibles, tienen cuentas de retención o para la fijación de los puños, así como no traumatizar a la pared del vaso con el tiempo, lo que induce trombosis o erosión 6.
En el video de la actualidad, se utiliza un sistema cerrado alimentado por aire comprimido para la perfusión transcardial. Otra opción es utilizar un sistema impulsado por la gravedad. La ventaja de los sistemas de gravedad, en comparación con los sistemas que utilizan el aire comprimido es que son simples, eficientes y no presentan riesgos de aire a presión entra en el sistema vascular. Sin embargo, la presión hidrostática ejercida por los sistemas de gravedad cambia continuamente durante la perfusión, y esto puede afectar los resultados histológicos 15. Dependiendo de qué tipo de estudios histopatológicos que se quiere realizar, puede ser ventajoso para la perfusión del animal con suero salino heparinizado primero. Esto es especialmente importantance al realizar la tinción de inmunofluorescencia con el fin de evitar los problemas causados por la autofluorescencia eritrocitos. Además, si el órgano de interés es el cerebro, la aorta descendente puede ser fijada para salvar fijador. Sin embargo, en los cerdos, este paso implica la disección de más y prolongará el procedimiento.
Disclosures
Todos los procedimientos fueron aprobados por el danés Animal Experimental Inspección, danés Ministerio de Justicia y se llevaron a cabo de acuerdo con los "Principios del cuidado de los animales de laboratorio" (NIH publicación N º 86-23, revisado en 1985).
Acknowledgments
El estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Lundbeck, La Fundación Karen Elise Jensen, el Fondo de Investigación Sanitaria de la Región Central de Dinamarca y el Instituto de Medicina Clínica del Hospital Universitario Aarhus. Reconocemos con gratitud la ayuda hábil de Donald F. Smith, Anders Steen Soerensen, Henrik Soerensen, Asbjoern Ettrup-Christensen, y el personal de Paaskehoejgaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation | |||
| Respirator | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| Suction with blunt tip | Unomedical | 34091181 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 (Laryngoscope set) | |
| Endotracheal tube 5.5 mm ID | Smiths Medical | 100/199/055 | |
| Stylet | Hudson RCI | 5-151001 | |
| Syringe 5ml | |||
| Stethoscope | Martin | 17-262-00 | |
| Bladder catherization | |||
| AquaFlate glycerine silicone Foley catheter 8-French with stylet | Rüsch | 178003 | |
| Speculum nasal | Martin | 36-859-50 | |
| Speculum rectal | Martin | 30-613-15 | |
| Blunt-tip forceps | Martin | 13-374-16 | |
| Catheter lubricant gel | |||
| Cathejell Lidocain | Montavit | CJL08501 | |
| Instillagel Comb. | Falcon BD | 08-40-200 | |
| A4 Urine drainage bag | Unomedical | 38 155 1S | |
| Adhesive tape | |||
| Femoral artery and vein catherization | |||
| Scalpel | Martin | 10-295-11 | |
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Tissue forceps | Martin | 12-100-14 | |
| Small blunt-tip surgical forceps | Martin | 13-375-13 | |
| Small self-retaining Tissue retractor | Martin | 15-753-13 | |
| Needleholder | Martin | 20-634-14 | |
| Surgical swaps | |||
| Suture with needle | |||
| Saline | |||
| Heparine | Leo Laboratories | 585679 | |
| 18-gauge venflon | BD Biosciences | 393206 | |
| 4-French brite tip sheaths with introducer and Seldinger guide wire | Cordis | 154-2629-1/0017 | |
| Transcardial perfusion | |||
| Pressurized perfusion system | Home made | ||
| Fume extraction system | Gram A/S | 01750000 and 0303700 | |
| Perfusant 5L | |||
| Blunt-tip surgical scissors | Martin | 11-881-18 | |
| Bone shears | F.S.T. | 16150-24 | |
| Large curved tip self-holding forceps | Martin | 13-421-18 | |
| Self retaining sternal retractor | Rudolf Medical | 7520-10 | |
| Pentobarbital | The Royal Veterinary and Agricultural University (KVL) | 200 mg/ml | |
| 22-gauge venflon | BD Biosciences | 393202 | |
References
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