Summary
हम एक माउस ES सेल आधारित परख का उपयोग करने के लिए Wnt / बीटा catenin और बीएमपी हृदयजनित अधिष्ठापन के दौरान संकेत सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण समय खिड़कियों की पहचान का वर्णन. विधि एक मानकीकृत मंच है कि मज़बूती से हृदयजनित दक्षता quantifies प्रदान करता है, और अन्य सेल प्रजातियों के अध्ययन के लिए लागू होता है.
Abstract
Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव कस एकाधिक कुंजी संकेत रास्ते के अस्थायी और स्थानिक विनियमन द्वारा नियंत्रित किया जाता है. अपनी समझ के लिए एक बाधा दौड़ के भेदभाव दक्षता की कुंजी संकेत घटनाओं के परिवर्तन correlating में विभिन्न तरीकों किया गया है. हम यहाँ एक माउस भ्रूण स्टेम (ते) सेल आधारित परख का उपयोग करने के लिए Wnt / बीटा catenin और बीएमपी हृदयजनित अधिष्ठापन के दौरान संकेत सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण समय खिड़कियों की पहचान का वर्णन. एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में भ्रूण निकायों (ईबीएस) करार के लिए स्कोरिंग, हम जल्दी से हृदयजनित दक्षता यों और Wnt / बीटा catenin और बीएमपी विशिष्ट न्यूनाधिक उपचार के बाद एक बार पाठ्यक्रम में संकेत सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण समय खिड़कियों की पहचान कर सकते हैं. प्रिंसिपल यहाँ उल्लिखित हृदय प्रेरण अकेले नहीं सीमित है, और कई अन्य सेल प्रजातियों के अध्ययन की दिशा में लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, 96 अच्छी तरह प्रारूप के आगे एक उच्च throughput, स्वचालित परख करने के लिए अधिक परिष्कृत प्रयोगात्मक परिकल्पना के परीक्षण के लिए अनुमति के रूप में विकसित किया जा क्षमता है.
Protocol
1. भ्रूण शारीरिक (EB) 96 दौर नीचे अच्छी तरह से microtiter प्लेट का उपयोग का गठन
- माउस ES कोशिकाओं माउस ES सेल मध्यम LIF के साथ पूरक के साथ 10cm सेल संस्कृति प्लेटों में आगे बढ़ें.
- जब ES कोशिकाओं उपयोग करने के लिए तैयार (आम तौर पर 50-70% संगम पर) कर रहे हैं, ES मीडिया को हटाने और कोशिकाओं 5ml बाँझ पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला.
- प्रत्येक थाली और 37 पर सेते प्लेटें ° सी 3 ~ 5 मिनट के लिए 2ml 0.05% / trypsin EDTA जोड़ें, 3 मिलीलीटर ES मीडिया के साथ trypsin EDTA बुझाने.
- 50ml बाज़ ट्यूबों और स्पिन करने के लिए 3 मिनट के लिए 1000 rpm पर कोशिकाओं स्थानांतरण.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, और resuspend सेल गोली EB मीडिया के वांछित राशि के साथ.
- सेल संख्या की गणना और 5 x10 3 EB मीडिया में कोशिकाओं / मिलीलीटर कोशिकाओं पतला.
- Multichannel विंदुक प्रयोग EB मीडिया के 100μl जोड़ने के 96 में से प्रत्येक में अच्छी तरह से कोशिकाओं को शामिल करने वाले दौर में अच्छी तरह से microtiter प्लेटें.
- प्लेस 96 - दौर एक इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से microtiter प्लेटें.
2. कुंजी संकेतन मार्ग (ओं) की महत्वपूर्ण समय खिड़कियों के cardiogenesis लिए पहचान
- 96 प्रत्येक में 96 अच्छी तरह microtiter 0 दिन, 1 दिन, 2 दिन, 3 दिन और 4 दिन, आदि के कुओं की त्रैमासिक जैसे विभिन्न समय बिंदुओं पर ES कोशिकाओं से युक्त प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से में विशिष्ट संकेत दे रास्ते और वाहन नियंत्रण के modulators जोड़ें अच्छी तरह से थाली (48 कुओं) प्रत्येक शुरू उपचार के समय बिंदु के लिए उपयोग किया जाता है.
- अलग रोक समय अंक पर हर 48 कुओं के लिए EB मीडिया बदलकर modulators धो लें. उदाहरण के लिए, ES 0 दिन से शुरू कोशिकाओं के लिए दो दिन के उपचार मिल, 2 दिन में बाहर modulators धोने. किसी भी अब इलाज के लिए 48 घंटे से EB ताजा modulators के साथ हर दो दिन में पूरक वांछित रोकने के लिए समय अंक जब तक मीडिया में परिवर्तन.
- 7 दिन के बाद एक खुर्दबीन के नीचे EB संकुचन जांच करते हैं. ईबीएस करार सकारात्मक लोगों के रूप में प्रत्येक अलग उपचार समय पाठ्यक्रमों के लिए ईबीएस करार के प्रतिशत प्राप्त करने के साथ कुओं कुल.
- ES cardiogenesis के लिए महत्वपूर्ण समय अंक समय फ्रेम में जो निहित करार ईबीएस संकेत modulators के द्वारा इलाज किया जब वाहन पर नियंत्रण की तुलना में उच्चतम प्रतिशत हैं.
3. ईबीएस में cardiogenesis के लिए संकेत के समय खिड़कियों के सत्यापन फांसी बूंदों से बना
- पीबीएस के 3-4 मिलीलीटर के साथ जोड़ने के लिए वाष्पीकरण रोकने के द्वारा पेट्री डिश तैयार है.
- चरणों 1.1 ~ 1.5 2.5x10 4 कोशिकाओं / एमएल अंतिम सेल घनत्व में ES कोशिकाओं को तैयार का पालन करें.
- आसान पहुँच के लिए जीवाणु डिश में सेल मिश्रण डालो. Multichannel विंदुक का प्रयोग, उल्टे lids पर 20 μl बूँदें (के बारे में 500 कोशिकाओं से युक्त) को जोड़ने. व्यक्तिगत बूंदों को स्पर्श करने की अनुमति नहीं है. आम तौर पर एक ढक्कन के ऊपर 80 बूँदें के लिए फिट कर सकते हैं. पीबीएस युक्त पकवान अधिक ढक्कन वापस पलटें. 24 घंटे या 48 घंटे के लिए सेते एक इनक्यूबेटर में EB गठन की अनुमति है.
- नीचे प्रत्येक ढक्कन से EB मीडिया और एक नया पेट्री डिश 2 ईबीएस के lids के पूल के 3 मिलीलीटर के साथ फांसी बूंदों से गठन EB धो लें. 10ml के एक कुल मात्रा EB मीडिया जोड़ें.
- स्थानांतरण ईबीएस में 0.2% जिलेटिन 4 दिन में लेपित प्लेटें 6 अच्छी तरह पर निलंबन. सामान्य में 30 ईबीएस प्रत्येक अच्छी तरह से स्थानांतरित कर रहे हैं. EB मीडिया जोड़ें 2 मिलीलीटर प्रत्येक के लिए अच्छी तरह अंतिम मात्रा.
- 96 अच्छी तरह से थाली प्रयोगों से पहचान की समय अवधि में modulators संकेत सेते हैं.
- निरीक्षण के बाद सात दिन और cardiogenesis खुर्दबीन के नीचे EB संकुचन आगे RT-पीसीआर immunostaining, और दूसरों को, यदि आवश्यक हो, द्वारा विशेषता हो सकता है.
Discussion
फांसी ड्रॉप विधि पारंपरिक EB गठन के लिए और इन विट्रो भेदभाव में विधि का इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, यह श्रमसाध्य है और प्रयोगात्मक लचीलापन सैन्य चिंताओं के कारण सीमा है. द्वारा एक ही टोकन, परिणाम भी अधिक मान्य करने के लिए मुश्किल experimenter के कौशल के रूप में सफल EB गठन और फांसी बूंदों के रूप में हेरफेर करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक सरल विधि के एक दौर तली एक एकल कदम प्रक्रिया के रूप में 96 अच्छी तरह से थाली में ईबीएस फार्म है. इस स्वरूप इन विट्रो भेदभाव में अनुमति देता है के लिए मानकीकृत हो और अधिक प्रयोगात्मक EB गठन और बहाव हेरफेर (जैसे न्यूनाधिक इसके अलावा या हटाने) की आसानी के कारण स्थिति को समायोजित कर सकते हैं. इसके अलावा, 96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप माउस ES कोशिकाओं में एक कुशल स्क्रीनिंग उपकरण किया जा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के दिग्गजों मामलों और NIH 5U01HL100398 और 1R01HL104040 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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