Summary
Мы описываем использование клетка мыши ES основан анализ, чтобы выявить критические временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение кардиогенного индукции. Метод обеспечивает стандартизированную платформу, которая надежно количественно кардиогенный эффективности, и она применима к изучению других клеточных поколений.
Abstract
Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток жестко контролируется временной и пространственной регуляции нескольких ключевых сигнальных путей. Одним из препятствий на пути ее понимание было различными способами при сопоставлении изменений ключевых сигнальных событий к дифференциации эффективности. Мы описываем здесь использовании мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) ячейке на основе анализа для выявления критических временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение кардиогенного индукции. По забив для заключения контрактов эмбриональных органов (ЭТ) в 96-луночный планшет формата, мы можем быстро количественно кардиогенный эффективности и выявления важнейших временные окна для Wnt / β-катенина и БМП сигнал активации в течение времени следующие конкретные процедуры модулятора. Основные изложенных здесь не ограничивается сердечной индукции в одиночку, и может быть применен к изучению многих других клеточных поколений. Кроме того, 96-луночного формата имеет потенциал для дальнейшего развития, как высокая пропускная способность, автоматизированные анализа для обеспечения тестирования более сложных экспериментальных гипотез.
Protocol
1. Эмбриональные орган (EB) образование использованием 96-круглым дном и микротитровальных пластин
- Расти ЭС клетках мыши в 10 см клеточных культур пластин с ЭСК мыши среде, дополненной LIF.
- При ЭС клетки готовы к использованию (как правило, на 50-70% слияния), удалите ES СМИ и промыть клетки один раз с 5 мл стерильной PBS.
- Добавить 2 мл 0,05% трипсин / ЭДТА на каждой пластине и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 3 ~ 5 минут, Quench трипсина ЭДТА 3 мл СМИ ES.
- Передача клетки 50мл сокола труб и спина при 1000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
- Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток с желаемым количеством EB СМИ.
- Граф номер ячейки и разбавленных клетки до 5 × 10 3 клеток / мл в EB СМИ.
- Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 100 мкл EB средах, содержащих клеток в каждую лунку 96 - круглый луночных микротитровальных.
- Место 96 - круглый луночных микротитровальных в инкубаторе.
2. Определение важнейших временные окна из ключевых сигнального пути (ы) для cardiogenesis
- Добавить модуляторы конкретных сигнальных путей и управления транспортным средством в каждую лунку 96-луночного микротитровальных чашек, содержащих стволовые клетки в различные моменты времени, например, день 0, день 1, день 2, день 3 и 4-й день и т.д. Половина скважин в каждом 96 -луночного планшета (48 скважин) используются для каждого момента времени начала лечения.
- Промыть модуляторы, изменив EB СМИ за каждые 48 скважин на различных пунктов остановки времени. Например, чтобы получить два дня лечения ЭС клетки, начиная со дня 0, промыть модуляторы в день 2. Для какого-либо лечения более 48 часов, изменение EB среде с свежим модуляторы каждые два дня до желаемой точки остановить время.
- Изучить EB сокращения под микроскопом после 7-й день. Оценка скважин с контрагентами ЭТ как позитивные, чтобы получить процент заражения ЭТ для каждого различные курсы время лечения.
- Критических точек времени для cardiogenesis ES являются временными рамками, в которых содержались высокий процент заражения ЭТ лечиться сигнализации модуляторы по сравнению с управления транспортным средством.
3. Проверка временных окон сигнализации для cardiogenesis в ЭТ из висят капли
- Подготовка чашки Петри с добавлением 3-4 мл PBS, чтобы предотвратить испарение.
- Выполните шаги 1,1 ~ 1,5 подготовить ЭС клеток в 2.5x10 4 клеток / мл конечного плотность клеток.
- Вылейте смесь в ячейки бактериальных блюдо для быстрого доступа. Использование многоканальной пипетки внести 20 мкл капли (содержащий около 500 клеток) на перевернутую крышку. Не допускать отдельные капли на ощупь. Вообще одна крышка может поместиться до 80 капель. Переверните крышку над блюдом содержащие PBS. Инкубируйте в течение 24 часов или 48 часов, чтобы позволить Б. образования в инкубаторе.
- Запивать EB формируется из висят капли из каждой крышке с 3 мл среды EB и бассейн 2 крышки ЭТ к новой чашки Петри. Добавить EB СМИ, чтобы общий объем 10 мл.
- Передача ЭТ в виде суспензии на 0,2% желатин покрытием 6-луночных на 4 день. В целом 30 ЭТ передаются в каждую лунку. Добавить EB средств массовой информации, чтобы получить 2 мл конечного объема для каждой скважины.
- Инкубируйте сигнализации модуляторы на период времени идентифицированы 96-луночного экспериментов пластины.
- Соблюдайте EB сокращения под микроскопом за днем 7 и cardiogenesis может быть в дальнейшем характеризуется RT-PCR, иммунной и других, если это необходимо.
Discussion
Висячей капли метод был обычный метод используется для EB формирования и дифференциации в пробирке. Однако, это трудоемкий и экспериментальные пределы гибкости из-за материально-технические проблемы. К тому же, результаты также более трудным для проверки, как мастерство экспериментатора имеет решающее значение для успешного формирования EB и манипуляции, как висят капли. Более простой способ заключается в форме ЭТ в круглым дном 96-луночный планшет в качестве одного этапа. Этот формат позволяет в пробирке дифференциации должны быть стандартизированы и могут вместить больше экспериментальных условиях из-за легкости формирования EB и вниз по течению манипуляции (например, добавление или удаление модулятор). Кроме того, 96-луночного формата пластины могут быть оптимизированы, чтобы быть эффективным инструментом скрининга в ЭС клетках мыши.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана по делам ветеранов и NIH гранты 5U01HL100398 и 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
