Summary
אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.
Abstract
דיפרנציאציה של בתאי גזע pluripotent נתונה לפיקוח הדוק על ידי ויסות של זמן ומרחב של מספר מסלולי איתות מפתח. אחד המכשולים כדי הבנה שלה כבר בשיטות מגוונות correlating שינויים של אירועים איתות מפתח יעילות בידול. אנו מתארים כאן את השימוש assay עובריים בעכבר (ES) בתאי גזע מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. עד מניה קבלנות גופים עובריים (EBS) בתבנית צלחת 96-טוב, אנחנו יכולים במהירות לכמת יעילות קרדיוגני ולזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך זמן לאחר טיפולי אפנן ספציפיים. המנהל המתוארים כאן אינו מוגבל אינדוקציה לב לבד, יכול להיות מיושם כלפי המחקר של שושלות תאים רבים אחרים. בנוסף, פורמט 96-היטב יש פוטנציאל להיות מפותחים יותר כמו תפוקה גבוהה, assay אוטומטית כדי לאפשר בדיקה של השערות ניסיוניות מתוחכמות יותר.
Protocol
1. עובריים (EB) היווצרות הגוף התחתון באמצעות 96 עגול גם צלחות microtiter
- לגדל תאים עובריים בעכבר בתא 10 ס"מ צלחות תרבות עם המדיום הסלולרי ES העכבר בתוספת LIF.
- כאשר תאים ES מוכנים לשימוש (בדרך כלל בנקודת המפגש 50-70%), להסיר ולשטוף התקשורת ES תאים פעם עם PBS סטרילי 5 מ"ל.
- הוסף 2ml 0.05% טריפסין / EDTA על כל צלחת צלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ~ 5 דקות, דובדבני טריפסין EDTA עם 3 מ"ל התקשורת ES.
- העברת התאים 50 מ"ל צינורות בז ספין בסל"ד 1000 למשך 3 דקות.
- הסר supernatant ו resuspend תא גלולה עם כמות הרצויה של EB התקשורת.
- ספירת תאים תאים לדלל עד 5 x10 3 תאים / מ"ל ב EB התקשורת.
- השתמש פיפטה רב להוסיף 100μl של EB התקשורת המכיל תאים לתוך הבאר כל אחד 96 - בסיבוב צלחות microtiter היטב.
- מקום 96 - בסיבוב צלחות microtiter היטב באינקובטור.
2. זיהוי חלונות זמן קריטי של מסלול איתות מפתח (ות) עבור cardiogenesis
- הוסף מאפננים של מסלולי איתות ספציפיים לשלוט ברכב לתוך הבאר כל אחד 96-היטב צלחות microtiter המכיל תאים ES בנקודות זמן שונות, כגון 0 היום, יום 1, יום 2, יום 3 יום 4, ועוד חצי בארות בכל 96 טוב, צלחת (48 בארות) משמשים עבור כל נקודת זמן ההתחלה של הטיפול.
- לשטוף את מאפננים ידי שינוי התקשורת EB עבור כל 48 בארות שונים בנקודות זמן לעצור. לדוגמה, כדי לקבל שני טיפולים ביום תאים ES החל מיום 0, לשטוף את מאפננים ביום 2. לטיפול יותר מ -48 שעות, שינוי התקשורת EB בתוספת מאפננים טריים כל יומיים עד לנקודות הזמן הרצוי לעצור.
- בדוק התכווצות EB תחת מיקרוסקופ אחרי יום 7. ציון בארות עם קבלנות EBS כמו חיוביים כדי לקבל אחוזי להידבקות EBS עבור כל הקורסים זמן שונים לטיפול.
- נקודות זמן קריטי עבור cardiogenesis ES הם מסגרות זמן שהכיל את האחוז הגבוה ביותר להידבקות EBS מטופלים על ידי מאפננים איתות בהשוואה לשלוט ברכב.
3. האימות של חלונות זמן של איתות עבור cardiogenesis ב EBS העשויים טיפות תלוי
- הכינו צלחות פטרי ידי הוספת עם 3-4 מ"ל של PBS על מנת למנוע אידוי.
- בצע את שלבים 1.1 ~ 1.5 להכין תאים ES ב 4 תאים 2.5x10 / תא מ"ל צפיפות סופית.
- יוצקים את התערובת לתוך תא חיידקי צלחת לצורך גישה קלה. בעזרת פיפטה רב, להוסיף 20 טיפות μl (המכיל כ - 500 תאים) על העפעפיים הפוכה. אין לאפשר את טיפות בודדות לגעת. בדרך כלל עפעף אחד יכול להתאים עד 80 טיפות. תהפכו את המכסה בחזרה על צלחת המכילה PBS. דגירה של 24 שעות או 48 שעות כדי לאפשר היווצרות EB באינקובטור.
- לשטוף את EB נוצר תלוי טיפות ממכסה כל אחד עם 3 מ"ל של התקשורת EB ובריכת 2 מכסים של EBS כדי בצלחת פטרי חדש. הוסף מדיה EB על בהיקף כולל של 10 מ"ל.
- העברת EBS ההשעיה על 0.2% מצופה ג'לטין 6-גם צלחות ביום 4. באופן כללי 30 EBS מועברים גם כל אחד. הוסף מדיה EB כדי לקבל את הנפח הסופי 2 מ"ל עבור כל טוב.
- דגירה איתות מאפננים את תקופת הזמן זיהו מ 96-היטב ניסויים צלחת.
- שים לב התכווצות EB תחת מיקרוסקופ אחרי יום 7 cardiogenesis עשוי להיות מאופיין יותר על ידי immunostaining, RT-PCR ועוד, במידת הצורך.
Discussion
השיטה ירידה תלוי כבר את השיטה המקובלת משמש ליצירת EB ו בידול חוץ גופית. עם זאת, מייגע גבולות הגמישות ניסיוני בשל חששות לוגיסטית. באותה מידה, תוצאות גם קשה יותר כדי לאמת את המיומנות של הנסיין הוא חיוני להיווצרות EB מניפולציה מוצלחת כמו טיפות תלוי. שיטה פשוטה יותר היא ליצור EBS בצלחת תחתית עגולה 96, וכן תהליך יחיד צעד. פורמט זה מאפשר בידול בתוך מבחנה להיות סטנדרטי יכול להכיל יותר תנאי הניסוי בשל הקלות של היווצרות EB ומניפולציה במורד הזרם (למשל בנוסף אפנן או הסרה). יתר על כן, 96-היטב את התבנית צלחת יכול להיות מותאם להיות כלי סינון יעיל בתאי גזע עובריים בעכבר.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי לענייני יוצאי צבא ו-NIH מענקים 5U01HL100398 ו 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
