Summary
我々は、/ Wntシグナルβ-カテニンと心原性誘導時のBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を識別するために、マウスES細胞ベースのアッセイの使用について説明します。方法は、確実に心原性効率を定量的に標準化されたプラットフォームを提供し、それが他の細胞系譜の研究に適用可能である。
Abstract
多能性幹細胞の分化は、しっかりと、複数のキーのシグナル伝達経路の時間的および空間的な調節によって制御されます。その理解へのハードルの一つは、分化の効率に重要なシグナル伝達事象の変化を相関させる様々な方法となっています。ここでは/ Wntシグナルβ-カテニンと心原性誘導時のBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を特定するためにマウス胚性幹（ES）細胞ベースのアッセイの使用について説明します。 96ウェルプレートフォーマットで胚体（EB）を契約のために得点することにより、我々はすぐに心原性効率性を定量化し、/ Wntシグナルβ-カテニンおよび特定の変調器の治療法は、次の時間経過におけるBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を識別することができます。ここで概説するプリンシパルは、単独で心臓の誘導に限定されるものではなく、他の多くの細胞系譜の研究に向かって適用することができます。さらに、96ウェルフォーマットでは、さらに高いスループット、より洗練された実験的な仮説のテストを可能にするために自動化されたアッセイとして開発される可能性があります。
Protocol
1。 96丸底マイクロタイタープレートを使用して胚様体（EB）形成
- LIFを添加したマウスES細胞培地で10cmの細胞培養プレート中のマウスES細胞を成長する。
- ES細胞は、（一般に50〜70％コンフルエントで）使用するための準備ができたら、ESのメディアを削除し、5ミリリットル滅菌PBSで細胞を1回すすいでください。
- 3〜5分間、37℃それぞれのプレートとプレートを、° Cに2ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを追加、3ミリリットルESのメディアとのトリプシンEDTAはクエンチ。
- 3分間、1000rpmで50ミリリットルファルコンチューブやスピンに細胞を移す。
- 上清を除去、およびEBメディア所望の量で再懸濁し細胞ペレット。
- 細胞数をカウントし、EB培地で5 × 10 3細胞/ mlに細胞を希釈する。
- ラウンドウェルマイクロタイタープレート - 96の各ウェルに細胞を含むEBメディア100μlのを追加するには、マルチチャンネルピペットを使用してください。
- 場所96 - インキュベーターに丸い穴マイクロタイタープレート。
2。心臓発生のための重要なシグナル伝達経路の重要な時間窓の識別（S）
- 各96など0日、1日目、2日、3日と4日目、井戸の等ハーフのような種々の時点でES細胞を含む96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに固有のシグナル伝達経路や車両制御の変調器を追加します。ウェルプレート（48ウェル）、治療の各々の開始時点に使用されます。
- 別の停止時点ですべての48ウェル用EBメディアを変更することにより、変調器を洗浄する。例えば、0日目から始まるES細胞の二日間の治療を得るために、2日目で変調器を洗い流す。 48時間より長い治療のためには、希望する停止時点まで2日ごとに新鮮な変調器を添加したEBのメディアを変更してください。
- 7日後に顕微鏡下でEBの収縮を調べます。それぞれ別の処理時間のコースでEBSを契約の割合を得るには正のものとしてEBSを契約して井戸を得点する。
- ESの心臓発生の重要な時点は、車両のコントロールと比較して変調器に信号を送ることによって処理されたEBSを契約の割合が最も高いが含まれる時間枠です。
3。ハング滴から作られたEBSで心臓発生のためのシグナリングのタイムウィンドウの検証
- 蒸発を防ぐために、PBSの3-4 mlを加えることによってペトリ皿を準備します。
- 2.5x10 4細胞/ mlの最終細胞密度でES細胞を準備する手順1.1〜1.5に従ってください。
- 簡単にアクセスするための細菌の皿に細胞混合物を注ぐ。マルチチャンネルピペットを使用して、反転蓋の上に20μlの滴（約500細胞を含む）に追加します。個々の液滴が触れないように注意してください。一般的に1つ蓋は80滴まで収めることができます。 PBSを含むシャーレ上の裏蓋を反転します。インキュベーターでEBを形成させるために24時間または48時間インキュベートする。
- EBのメディアとプールEBの2ふた新しいシャーレに3mlでそれぞれの蓋から液滴をぶら下げから形成されたEBをきれいに洗う。 10ミリリットルの合計体積にEBのメディアを追加します。
- 4日目で0.2％ゼラチンコートした6ウェルプレート上に懸濁液中の転送EBの。一般的に30にEBは各ウェルに転送されます。各ウェルの2ミリリットル最終容量を得るためにEBのメディアを追加します。
- 96ウェルプレートの実験から同定された期間でのシグナル伝達モジュレーターをインキュベートする。
- 必要に応じて7日目と心臓発生後に顕微鏡下でEBの収縮を観察し、さらに、RT - PCR、免疫染色などによって特徴付けられ得る。
Discussion
ハンギングドロップ法では、EB形成のためとin vitroにおける分化に使用される従来の方法であった。しかし、それは面倒ですし、物流の懸念のために実験的な柔軟性を制限します。実験者のスキルがハングしドロップとして成功したEBの形成と操作に不可欠なものと同じトークンによって、結果にも検証がより困難です。簡単な方法は、単一ステップのプロセスとして、丸底96ウェルプレートでEBSを形成することである。このフォーマットを標準化するためにin vitroでの分化に可能にし、EBの形成と下流の操作の容易さ（例えば、変調器の追加や削除）のために多くの実験条件に対応することができます。さらに、96ウェルプレートフォーマットは、マウスES細胞における効率的なスクリーニングツールとなるように最適化することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、退役軍人とNIHの助成金5U01HL100398と1R01HL104040によってサポートされていました。
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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