Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Summary

Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.

Abstract

Tuşa birden fazla sinyal yollarının zamansal ve mekansal yönetmelikle pluripotent kök hücre farklılaşması sıkı kontrol edilir. Anlayışı engellerden biri farklılaşma verimliliği önemli sinyal olayların değişiklikler arasındaki ilişkiyi çeşitli yöntemler olmuştur. Biz burada (ES), bir fare embriyonik kök hücre temelli tahlil Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. 96-plaka formatında embriyonik organları (EBS) sözleşme için puanlama, biz hızlı kardiyojenik verimliliğini ölçmek ve Wnt / β-katenin ve belirli modülatör tedavileri aşağıdaki bir zaman içerisinde BMP sinyal aktivasyonu için çok önemli zaman belirlemek. Burada özetlenen başlıca kalp indüksiyon yalnız bunlarla sınırlı değildir, ve diğer pek çok hücre soylarının çalışma yönünde uygulanabilir. Buna ek olarak, 96-well formatında, daha yüksek verimlilik, daha sofistike deneysel hipotezleri test etmek için izin verecek şekilde otomatik tahlil olarak geliştirilen potansiyeline sahiptir.

Protocol

1. 96-yuvarlak alt microtiter plakalar kullanarak Embriyonik Vücut (EB) oluşumu

1. Fare fare ES hücre orta LIF ile desteklenmiş 10cm hücre kültürü plakaları ES hücrelerinin büyütün.
2. ES hücrelerinin (genellikle% 50-70 izdiham) kullanıma hazır olduğunda, ES medya kaldırmak ve 5ml steril PBS ile hücreler bir kez yıkayın.
3. 3 ~ 5 dakika için, her bir plaka ve 37 inkübe plakaları ° C için 2 ml% 0.05 'tripsin / EDTA, 3 ml ES medya ile tripsin EDTA Quench.
4. 1000 rpm'de 3 dakika 50ml şahin tüpler ve spin hücreleri aktarın.
5. Süpernatantı ve EB medya istenilen miktarı ile tekrar süspansiyon hücre pelletini.
6. Hücre sayısını saymak ve EB medyada 5 x10 ³ hücre / ml hücreleri sulandırmak.
7. - 96, her kuyuya yuvarlak iyi microtiter plakalar hücreleri içeren EB medya 100μl eklemek için çok kanallı pipet kullanın.
8. Yeri 96 - bir inkübatör içine yuvarlak iyi microtiter plakalar.

2. Cardiogenesis için önemli sinyal yolağı (ler) in kritik zaman pencereleri tanımlanması

1. Her 96, 0 gün, günde 1 gün 2 gün 3 gün 4, kuyular, vb Yarım gibi çeşitli zaman noktalarında ES hücreleri içeren 96-kuyu microtiter plakalar her bir kuyunun içine özel bir sinyal yollar ve araç kontrolü modülatörleri ekle iyi plaka (48 kuyulardan), tedavi her başlangıç ​​zaman noktası için kullanılır.
2. Modülatörleri, farklı durdurma zaman noktalarında her 48 kuyu için EB ortamı değiştirerek yıkayın. Örneğin, gün 0 itibaren ES hücreleri için iki günlük bir tedavi almak için, günde 2 modülatörleri yıkayın. 48 saatten daha uzun süre herhangi bir tedavi için, istenen durma zamanı noktalarına kadar her iki günde bir, taze modülatörleri ile desteklenmiş EB ortamı değiştirmek.
3. 7 gün sonra mikroskop altında EB daralma inceleyin. Puan yüzdeleri, her biri farklı bir tedavi süresi dersler için EBS sözleşme almak için pozitif olanlar gibi EBS sözleşme ile kuyu.
4. ES cardiogenesis için kritik zaman noktalarında araç kontrol ile kıyaslandığında EBS sinyalizasyon modülatörleri tarafından tedavi edilen sözleşme, en yüksek oranda içerdiği hangi zaman dilimlerinde.

3. EBS cardiogenesis için sinyal zaman pencereleri Doğrulama asılı damlacıklar

1. Buharlaşmasını önlemek için 3-4 ml PBS ekleyerek Petri kapları hazırlayın.
2. Adımları 1.1 ~ 1.5 ES hücrelerinin 2.5x10 ⁴ hücre / ml son hücre yoğunluğu hazırlamak için izleyin.
3. Kolay erişim için bakteriyel çanak içine hücre karışımı dökün. Çok kanallı pipet kullanarak, ters kapakları üzerine 20 ul damla (yaklaşık 500 hücre içeren) ekleyin. Bireysel damlacıkları temas etmesine izin vermeyin. Genellikle bir kapak 80 damla kadar sığabilir. PBS içeren çanak kapağı üzerinde geri çevirin. Bir kuluçka EB oluşumunu sağlamak için 24 saat veya 48 saat inkübe edin.
4. EB medya ve havuz EBS yeni bir Petri kabı 2 kapakları 3 ml her kapağı asılı damlacıklar oluşur EB aşağı doğru yıkayın. EB medya 10ml toplam hacmi ekleyin.
5. % 0.2 günde 4 jelatin kaplı 6 kuyucuğu üzerine askıya Transfer EBS. Genel 30 EBS, her bir kuyunun aktarılır. Her bir kuyu için 2 ml son hacmi EB medya ekleyin.
6. 96-plaka deneyleri belirlenen süre modülatörleri sinyalizasyon inkübe edin.
7. Gün 7 ve cardiogenesis sonra mikroskop altında EB daralma, RT-PCR, immün ve diğerleri, gerekirse daha ile karakterize olabilir dikkat edin.

Discussion

Asılı damla yöntemi, EB oluşumu için ve in vitro ayrımında kullanılan geleneksel bir yöntem olmuştur. Ancak, zahmetli ve lojistik endişeleri nedeniyle deneysel esnekliği sınırlar. Deneyci beceri asılı damla kadar başarılı EB oluşumu ve manipülasyon için çok önemli olduğu gibi aynı şekilde, sonuçları doğrulamak için daha zordur. Daha basit bir yöntem, tek aşamalı bir süreç olarak Yuvarlak tabanlı 96-plaka EBS oluşturmaktır. Bu biçim standart in vitro farklılaşma sağlar ve daha deneysel koşullar altında, EB oluşumu ve alt manipülasyon (örneğin modülatör eklenmesi veya çıkarılması) kolaylığı nedeniyle barındırabilir. Ayrıca, 96 plaka biçimi fare ES hücrelerinin etkin bir tarama aracı olarak optimize edilebilir.

Materials

Mouse CGR8 cells are mainly used.

ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF.

EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution.