Summary
Nous décrivons l'utilisation d'un test sur des cellules de souris ES base pour identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l'activation du signal BMP lors de l'induction cardiogénique. La méthode fournit une plate-forme standardisée qui quantifie l'efficacité fiable cardiogénique, et elle est applicable à l'étude de lignées cellulaires d'autres.
Abstract
La différenciation des cellules souches pluripotentes est étroitement contrôlée par la régulation temporelle et spatiale des multiples voies de signalisation clés. Un des obstacles à sa compréhension a été la diversité des méthodes de corrélation des modifications des principaux événements de signalisation à l'efficacité de différenciation. Nous décrivons ici l'utilisation d'un test de la souris les cellules souches embryonnaires (ES) en fonction d'identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l'activation du signal BMP lors de l'induction cardiogénique. Par notation de contracter des organes embryonnaires (EB) dans un format de plaque de 96 puits, nous pouvons rapidement quantifier l'efficacité cardiogénique et d'identifier les fenêtres moment crucial pour Wnt / β-caténine et l'activation du signal BMP dans un cours à temps suite à des traitements spécifiques modulateur. Les principaux décrits ici ne se limite pas à l'induction cardiaques seul, et peut être appliquée à l'étude de plusieurs lignées cellulaires d'autres. En outre, le format de 96 puits a le potentiel d'être développé comme un débit élevé, un dosage automatisé pour permettre de tester les hypothèses expérimentales plus sophistiquées.
Protocol
1. Corps embryonnaire (EB) en utilisant la formation de base 96-rondes et des plaques de microtitration
- Cultiver des cellules ES de souris dans des assiettes de 10 cm de culture de cellules de souris avec des moyennes de cellules ES complétée par FRV.
- Lorsque les cellules ES sont prêts à l'emploi (généralement à 50-70% de confluence), retirer le support ES et rincer les cellules une fois avec 5ml de PBS stérile.
- Ajouter 2ml 0,05% de trypsine / EDTA à chaque plaque et incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 ~ 5 minutes, la trypsine EDTA Quench avec 3 supports ES ml.
- Transfert aux cellules de tubes Falcon 50 ml et centrifuger à 1000 rpm pendant 3 minutes.
- Retirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec la quantité désirée de EB médias.
- Comptez le nombre de cellules et de diluer les cellules à 5 x10 3 cellules / ml dans EB médias.
- Utilisez pipette multicanaux d'ajouter 100 pi d'EB milieux contenant des cellules dans chaque puits de 96 - rondes microplaques bien.
- Placer 96 - rondes microplaques bien dans un incubateur.
2. Identification des fenêtres de temps critique de la voie de signalisation clés (s) pour cardiogenèse
- Ajouter modulateurs spécifiques des voies de signalisation et de contrôle du véhicule dans chaque puits de plaques de microtitration à 96 puits contenant des cellules ES à des moments différents comme le jour 0, jour 1, jour 2, jour 3 et jour 4, Half etc de puits dans chaque 96 bien-plaque (48 puits) sont utilisés pour chaque point de temps de démarrage du traitement.
- Laver les modulateurs en changeant des médias EB pour chaque 48 puits à différents points de temps d'arrêt. Par exemple, pour obtenir deux jours de traitement pour les cellules ES à partir de 0 jour, laver modulateurs au jour 2. Pour tout traitement de plus de 48 heures, le changement des médias EB complété avec des modulateurs frais tous les deux jours jusqu'à les points souhaités temps d'arrêt.
- Examiner la contraction EB sous un microscope après jour 7. Score des puits avec traitance EBS positives pour obtenir des pourcentages de contracter EBS pour chaque cours différents temps de traitement.
- Les points moment critique pour cardiogenèse ES sont les délais dans lesquels contenaient le plus haut pourcentage de contracter EB traitées par les modulateurs de signalisation par rapport à la maîtrise du véhicule.
3. Vérification des fenêtres temporelles de signalisation pour cardiogenèse dans EBS fabriqués à partir de gouttelettes suspendues
- Préparer des boîtes de Petri en ajoutant avec 3-4 ml de PBS pour empêcher l'évaporation.
- Suivez les étapes 1,1 ~ 1,5 pour préparer les cellules ES à 2.5x10 4 cellules / ml densité cellulaire finale.
- Verser le mélange dans un plat de cellules bactériennes pour un accès facile. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 20 gouttes ul (contenant environ 500 cellules) sur les couvercles inversé. Ne pas laisser les gouttelettes individuelles au toucher. En général, un couvercle peut accueillir jusqu'à 80 gouttes. Retournez le couvercle sur le plat contenant du PBS. Incuber pendant 24 heures ou 48 heures pour permettre la formation EB dans un incubateur.
- Laver EB formé à partir de gouttelettes suspendues de chaque couvercle avec 3 ml de milieu EB et piscine 2 couvercles d'EBS pour un nouveau plat de Pétri. Ajouter le média EB à un volume total de 10ml.
- Transfert EB en suspension sur 0,2% de gélatine revêtement des plaques 6 puits à 4 jours. En général 30 EBS sont transférés à chaque puits. Ajouter le média EB pour obtenir le volume de 2 ml finale pour chaque bien.
- Incuber de signalisation modulateurs à la période identifiée à partir de 96 puits expériences assiette.
- Observez la contraction EB sous microscope après jour 7 et cardiogenèse peut encore être caractérisé par RT-PCR, immunomarquage et d'autres, si nécessaire.
Discussion
La méthode de la goutte suspendue a été la méthode conventionnelle utilisée pour la formation EB et la différenciation in vitro. Cependant, il est laborieux et les limites de flexibilité expérimentale en raison de problèmes logistiques. De la même façon, les résultats sont également plus difficiles à valider les compétences de l'expérimentateur est cruciale pour la formation EB succès et la manipulation de gouttes suspendues. Une méthode plus simple est de former EBS dans une plaque à fond rond de 96 puits comme un processus en une seule étape. Ce format permet la différenciation in vitro d'être standardisées et peut accueillir plus de conditions expérimentales en raison de la facilité de formation EB et la manipulation en aval (par exemple ajout ou le retrait de modulateur). Par ailleurs, le format 96 puits de plaque peut être optimisé pour être un outil de dépistage efficace dans les cellules ES de souris.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Anciens Combattants et des subventions du NIH et de 5U01HL100398 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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