Summary
我们描述了一个小鼠胚胎干细胞实验，以确定Wnt信号/β- catenin和BMP期间心感应信号激活的关键时间窗。该方法提供了一个标准化的平台，可靠的量化心源性效率，它是适用于其他细胞谱系的研究。
Abstract
多能干细胞分化受到严格控制时间和空间的多个关键信号通路的调控。的障碍之一，它的理解已经在分化效率的关键信号事件的变化及其相关的各种方法。我们在这里描述了一个小鼠胚胎干（ES）细胞检测Wnt信号/β- catenin和BMP期间心源性诱导的信号激活，以确定关键的时间窗口。承包胚胎机构（EBS），在96孔板格式的得分，我们可以快速地量化源性效率，并确定Wnt信号/β- catenin和BMP在一个时间过程，下面的具体调制器处理的信号激活的关键时间窗。这里列出的主要是不局限于心脏感应，并可以实现许多其他的细胞谱系的研究应用。此外，96孔板格式已作为一种高通量，自动化检测，以使测试更复杂的实验假设还有待进一步开发的潜力。
Protocol
1。胚胎体（EB）使用96圆底的形成孔板
- 10厘米细胞与小鼠ES细胞与LIF的培养基中培养板中成长的小鼠胚胎干细胞。
- 当ES细胞是准备使用（一般在50-70％汇合），删除ES的媒体，用5ml无菌PBS冲洗细胞一次。
- 添加3〜5分钟2毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA，每块板和孵育板在37 ° C，淬火胰蛋白酶EDTA 3毫升ES媒体。
- 3分钟的转速在1000至50ml猎鹰管和自旋转移细胞。
- 去除上清液，重悬细胞沉淀所需金额的EB媒体。
- 计数细胞数量和稀释细胞3 × 10 5细胞/毫升在EB媒体。
- 使用多道移液器的EB媒体添加到每个96100μL含有细胞 - 全面孔板。
- 放置96 - 孔板，全面进入孵化器。
2。关键时刻的关键信号通路（S）窗口标识cardiogenesis
- 每孔96孔酶标板含ES细胞在不同时间点，如0天，每天1次，每日2次，3和第4天天，等半井添加到调制器特定的信号转导通路和车辆控制在每96孔板（48孔）用于每个治疗的起始时间点。
- 洗出的调制，通过改变不同的停车时间点为每48口井的EB媒体。例如，要获得两个胚胎干细胞从0天开始每天治疗，洗出在第2天调制器。任何治疗时间超过48小时，改变，直到所需的停机时间点，每两天补充新鲜调制的电子束媒体。
- 检查后第7天显微镜下的EB收缩。承包为阳性的分化承包分化为每个不同的治疗时间课程的百分比分数井。
- 为ES cardiogenesis的关键时间点的时间框架，其中载有承包胚处理由信号调制器相比，对车辆的控制比例最高的。
3。核查cardiogenesis EBS中的信号的时间窗口挂水滴
- 准备加入3-4毫升的PBS的培养皿中，以防止蒸发。
- 按照步骤1.1〜1.5，以准备在2.5 × 10 4细胞/ ml的最终细胞密度的ES细胞。
- 为方便倒入细菌培养皿细胞的混合物。使用多道移液器，倒盖添加到20μL滴（含约500个细胞）。不要让个别的水滴接触。一般来说一个盖子可容纳多达80滴。包含PBS菜翻转的盖子。孵育24小时或48小时内允许EB孵化器的形成。
- 洗下来挂从每个盖子与3毫升的EB媒体和池EBS的2到一个新的培养皿盖水滴形成的EB。 EB媒体添加到总体积为10ml。
- 传输胚到0.2％明胶涂层的6孔板，在第4天暂停。一般30的胚被转移到每口井。添加EB媒体2毫升每孔终体积。
- 孵育信号调制器在确定的时间从96孔板实验内。
- 后第7天，并cardiogenesis显微镜下观察EB收缩可能会进一步通过RT - PCR技术，免疫和其他人，如果有必要的特点。
Discussion
悬滴法已获得EB病毒在体外诱导分化形成和使用的常规方法。但是，它是费力，限制了实验的灵活性，由于后勤问题。同样的道理，结果也更难以验证的实验者的技巧是至关重要的成功EB形成和操纵挂滴的。一个简单的方法是，形成一个圆底96板作为一个单步的过程EBS。这种格式允许在体外分化规范和可容纳更多的EB形成和下游的操作（如调制器的添加或删除）缓解由于实验条件。此外，96孔板格式可以优化在小鼠胚胎干细胞是有效的筛检工具。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由退伍军人事务部和美国国立卫生研究院拨款5U01HL100398和1R01HL104040支持。
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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