Summary
Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.
Abstract
Diferenciación de las células madre pluripotentes está estrechamente controlada por la regulación temporal y espacial de múltiples vías de señalización claves. Uno de los obstáculos a su entender ha sido los métodos variados en la correlación de los cambios de los principales eventos de señalización a la eficiencia de la diferenciación. Se describe aquí el uso de un ensayo con ratones con células madre embrionarias (ES) en base a identificar las ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. Anotando para la contratación de los órganos del embrión (EBS) en un formato de placa de 96 pocillos, que rápidamente se puede cuantificar la eficiencia cardiogénico e identificar las ventanas cruciales tiempo para Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP en un curso de tiempo después de los tratamientos específicos modulador. El director describe aquí no se limita a la inducción cardiaca solo, y se puede aplicar al estudio de muchos linajes de células. Además, el formato de 96 y tiene el potencial para seguir desarrollándose como un alto rendimiento, análisis automatizado para permitir la comprobación de hipótesis experimentales más sofisticados.
Protocol
1. Cuerpo embrionarias (EB) con la formación de fondo redondo de 96 pocillos de microtitulación
- Se cultivan las células ES de ratón en placas de 10 cm de cultivo celular con células ES de ratón medio complementado con LIF.
- Cuando las células ES están listos para su uso (generalmente en la confluencia 50-70%), retire el material ES y aclarar las células una vez con 5 ml de PBS estéril.
- Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a cada placa y las placas se incuban a 37 ° C durante 3 a 5 minutos, Quench tripsina EDTA con 3 ml de medios ES.
- La transferencia de células a tubos Falcon de 50 ml y giran a 1000 rpm durante 3 minutos.
- Extraer el sobrenadante, resuspender el sedimento celular y con la cantidad deseada de los medios de comunicación EB.
- Cuente el número de células y diluir las células a 5 x 10 3 células / ml en los medios de comunicación EB.
- Use una pipeta multicanal para añadir 100μl de EB medios que contienen células en cada pocillo de 96 - ronda de placas microtiter.
- Lugar 96 - ronda de placas de microtitulación y en una incubadora.
2. Identificación de ventanas de tiempo crítico de la vía de señalización clave (s) de cardiogénesis
- Añadir moduladores de determinadas vías de señalización y control del vehículo en cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pozos que contienen células madre embrionarias en distintos momentos, como el día 0, día 1, día 2, los días 3 y 4, etc mitad de los pozos en cada uno de 96 y placa (48 pozos) se utilizan para cada punto de la hora de inicio del tratamiento.
- Lavar bien los moduladores cambiando los medios de comunicación EB por cada 48 pozos en diferentes puntos de tiempo de parada. Por ejemplo, para conseguir dos días de tratamiento de células madre embrionarias a partir de el día 0, lavar la moduladores en el día 2. Para que cualquier tratamiento por más de 48 horas, cambio de los medios de comunicación EB complementado con moduladores fresca cada dos días hasta que la hora que desee detener.
- Examine la contracción EB bajo el microscopio después del día 7. Puntuación de los pozos con la contratación EBS como los positivos para obtener los porcentajes de contratación EBS para cada uno: tiempo de tratamiento diferentes.
- Los momentos críticos para cardiogénesis ES son los plazos en los que figura el porcentaje más alto de contraer EBs tratados con moduladores de la señalización en comparación con el control del vehículo.
3. Verificación de las ventanas de tiempo de señalización para cardiogénesis en EBs hecho de gotas colgantes
- Preparar platos Petri añadiendo con 3-4 ml de PBS para evitar la evaporación.
- Siga los pasos del 1.1 ~ 1.5 para preparar células madre embrionarias en 2.5x10 4 células / ml de densidad celular final.
- Vierta la mezcla de células bacterianas en el plato de fácil acceso. Utilizando una pipeta multicanal, 20 gotas l (que contiene alrededor de 500 células) en las tapas invertidas. No permita que las gotas individuales al tacto. Por lo general una tapa puede albergar hasta 80 gotas. Voltear la tapa de nuevo sobre el plato que contiene PBS. Incubar durante 24 horas o 48 horas para permitir la formación de EB en una incubadora.
- Lave EB formado a partir de colgar las gotitas de cada tapa con 3 ml de los medios de comunicación EB y piscina 2 tapas de EBS para una nueva placa de Petri. Añadir los medios de comunicación EB a un volumen total de 10ml.
- Transferencia de EBS en suspensión en el 0,2% de gelatina recubiertas placas de 6 pocillos en el día 4. En general 30 EBs se transfieren a cada pocillo. Añadir los medios de comunicación EB para obtener el volumen final de 2 ml para cada pozo.
- Incubar moduladores de señalización en el período de tiempo identificados a partir de 96 experimentos y placa.
- Observar la contracción EB bajo el microscopio después del día 7 y cardiogénesis puede ser caracterizado además por RT-PCR, tinción y otros, si es necesario.
Discussion
El método de la gota colgante ha sido el método convencional utilizado para la formación de EB y en la diferenciación in vitro. Sin embargo, es laborioso y limita la flexibilidad de experimentación debido a problemas de logística. De la misma manera, los resultados también son más difíciles de validar como la habilidad del experimentador es crucial para la formación de EB éxito y la manipulación en forma de gotas colgantes. Un método más simple consiste en formar EBS en un plato de fondo redondo de 96, así como un proceso de un solo paso. Este formato permite la diferenciación in vitro para ser estandarizados y pueden alojar a más condiciones experimentales debido a la facilidad de la formación de EB y la manipulación posterior (por ejemplo, además del modulador o la eliminación). Además, el formato de 96 pocillos placa puede ser optimizado para ser una herramienta de evaluación eficiente en las células madre embrionarias de ratón.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Asuntos de los Veteranos y las subvenciones del NIH 5U01HL100398 y 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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