Summary
Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.
Abstract
Die Analyse der Lipid-Protein-Wechselwirkung ist schwierig, da Lipide in Zellmembranen eingebettet sind und somit nicht zugänglich sind, die meisten Reinigungsverfahren. Als Alternative können Lipide auf flachen Oberflächen beschichtet werden, wie für die Lipid-ELISA und Plasmon-Resonanz-Spektroskopie eingesetzt. Allerdings tun Oberflächenbeschichtung Lipide bilden keine Mikrodomänenstruktur Strukturen, die möglicherweise für die Lipid-bindenden Eigenschaften wichtig. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht für die Reinigung von größeren Mengen an Proteinen Bindung an ihr Ziel Lipide ermöglichen.
Zur Überwindung dieser Grenzen testen Lipid-Protein-Interaktions-und Lipid-bindende Proteine zu reinigen entwickelten wir eine neuartige Methode bezeichnet Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS). In diesem Verfahren werden Lipidvesikel mit dem Ziel Lipid Phosphatidylserin und als Anker für die Lipid-Annexin V MACS vorbereitet. Phosphatidylserin ist ein allgegenwärtiges Zellmembran Phospholipid, die eine hohe Affinität zum Protein Annexin V. Mit Magnetic Beads konjugiert Annexin V die Phosphatidylserin-enthaltende Lipid-Vesikel werden die magnetischen Kügelchen binden zeigt. Wenn die Lipid-Vesikel mit einer Zelle inkubiert Lysat die Proteinbindung an die Ziel-Lipid wird auch auf die Kügelchen gebunden und kann co-gereinigt werden mittels MACS. Diese Methode kann auch verwendet werden, um zu testen, ob rekombinanten Proteinen rekonstituieren einen Protein-Komplex Bindung an die Ziel-Lipid.
Wir haben diese Methode benutzt, um die Interaktion von atypischen PKC (aPKC) mit den Sphingolipid Ceramid und die Zusammenarbeit zu reinigen Prostata Apoptose Antwort 4 (PAR-4), ein Protein-Bindung an Ceramid-assoziierten aPKC zeigen. Wir haben auch diese Methode für die Wiederherstellung eines Ceramid-assoziierten Komplex von rekombinanten aPKC mit der Zellpolarität-verwandte Proteine Par6 und Cdc42 verwendet. Da Lipidvesikel mit einer Vielzahl von Sphingo-oder Phospholipiden hergestellt werden können, bietet LIMACS eine vielseitige Test für die Lipid-Protein-Wechselwirkung in einer Lipid-Umgebung, die sehr ähnlich ist, dass der Zellmembran. Weitere Lipid-Protein-Komplexe können unter Verwendung Proteomanalyse von Lipid-bindenden Proteins mit der Lipid-Vesikel co-gereinigt werden.
Protocol
1. Einführung
Die Lipid-Vesikel-vermittelten Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS)-Technik wurde in unserem Labor entwickelt zu isolieren Ceramid-associated Protein-Komplexe 1-3. Ursprünglich waren die Lipidvesikel von Ceramid und Phosphatidylserin, die für MACS mit magnetischen Partikel-konjugierten Annexin V (hoch affine zu Phosphatidylserin) zu den Vesikeln und deren assoziierten Proteinen zu isolieren erlaubt hat. Wir haben die LIMACS verwendete Technik für die in vitro Rekonstitution eines Ceramid-assoziierten Polarität komplexer und die Isolierung von Ceramid-bindenden Proteinen aus Zelllysaten 3. LIMACS modifiziert mit anderen Interaktionspartner für die Isolierung der Vesikel (zB Glycolipid-specifc Lektine oder Lipid-Antikörper) sein.
2. Experimentelle Verfahren
Herstellung von Lipid-Vesikel und aPKCBinding Assays
- Lipidvesikel sind aus getrockneten Mischungen von äquimolaren Mengen von Phosphatidylserin (105 ug) und C16-Ceramid (85 ug) folgende modifizierte Verfahren für große Liposomenzubereitung 1,4-7 erhalten.
- Die Lipid-Gemische werden dann resuspendiert und beschallt für 1 h in 100 ul Vesikel Puffer bestehend aus 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl.
- Nach Zugabe von 300 ul Vesikel-Puffer mit 0,1 mM MnCl 2 ergänzt, werden die Proben bei 12.000 μ g für 20 min bei 4 ° C zentrifugiert
- Das Pellet (große Lipidvesikel) ist in 100 ul Vesikel-Puffer resuspendiert und mit 1 nmol Vybrant CM-DII für 1 h bei 37 ° C, um die Vesikelfraktion nach MACS Trennung zu visualisieren. Vybrant CM-DII ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff speziell zur Einbindung in Lipidmembranen.
- Ein Waschmittel-free Zelllysat wird durch Beschallung / Homogenisierung von Zellen in 300 ul hypotonischen Puffer (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) mit Protease-und Phosphatase-Inhibitoren) durch Entfernung des membranösen Schutt, gefolgt von Zentrifugation vorbereitet. Ein Zentrifugationsschritt bei 100.000 xg für 1 h sollte hinzugefügt werden, um eine Verunreinigung des Zelllysat mit endogenen Membranen, die Phosphatidylserin zu vermeiden.
- Das geklärte Lysat wird auf die Lipid-Vesikel Suspension zugegeben und das Gemisch wird für 2 h bei 4 ° C inkubiert
- Das Reaktionsgemisch wird mit 20 ul 20x Annexin V-Bindungspuffer und 50 ul einer Lösung mit magnetischen Beads konjugiert Annexin V ergänzt, gefolgt von Inkubation für 1 h bei 4 ° C.
- MACS ist nach Angaben des Herstellers (Miltenyi Biotec, Inc.) Protokoll durchgeführt. Das Vorhandensein und die Menge der Lipid-Vesikel wird durch die Überwachung der Vybrant CM-DII Fluoreszenz in den Flow-Through-und Elutionsfraktionen mit einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenz-Reader bestimmt.
- Die lineare Korrelation zwischen der Höhe der vesikulären Lipid-und Fluoreszenz-Intensität der Vesikel-gebundenem Vybrant CM-DII wird durch quantitative Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) der Lipid-Gemisch aufgetragen, um Annexin V-basierten Macs überprüft.
- Die Spezifität der Bindungsreaktion aPKC oder andere Proteine, die Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel wird durch einen Antikörper Kompetitionsassay mit 1 ug anti-PKCζ polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das Zelllysat für 1 h bei 4 ° C inkubieren vor der Inkubation mit verifizierten die Lipid-Vesikel.
- Die Proteinbindung an Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel in der MACS Eluat wird durch SDS-PAGE und Immunoblot analysiert.
In-vitro-Lipid-Protein-Komplex Polarität
- Die in vitro Rekonstitution eines Lipid-Protein-Polarität Komplex ist nach dem LIMACS Verfahren wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, durchgeführt. In kurzen, Phosphatidylserin (420 ug) und C16-Ceramid (107 ug) wird aus organischen Lösungsmittel getrocknet.
- Die getrockneten Lipide sind unter Beschallung in 500 ul der Vesikel-Puffer (; 150 mM NaCl 50 mM Tris / HCl, pH 7,5) resuspendiert.
- Fünf ul 10 mM MnCl 2, 1 ul Vybrant CM-DII, und 500 ng PKCζ (humaner rekombinanter) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch inkubiert undergentle Agitation für 60 min bei 4 ° C.
- Vybrant CM-DII gebeizt Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel werden durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C wieder
- Das Pellet (pink) wird in 100 ul Tris-Puffer und ergänzt mit γS-GTP (100 uM), BIP (1 mM), GST-Par6 (100 ng), oder GST-Cdc42 (500 ng) und weitere 3 inkubiert h bei 4 ° C (jede andere Kombination von rekombinanter Proteine von Interesse kann hier eingesetzt werden).
- Annexin V-Puffer (5 ul einer 20x Stammlösung) und Annexin V-konjugierten magnetischen Beads (50 ul) zugegeben und die Reaktionsmischung unter leichtem Schütteln für weitere 30 min bei 4 ° C inkubiert
- Annexin V-MACS ist im Anschluss an die Lieferanten-Protokoll wie oben beschrieben durchgeführt. Die Elutionsfraktion (1 ml) wird mit 10 pg des reinen Ovalbumin als Niederschlag Hilfe ergänzt. Das Protein wird durch Wessel-Flügge Fällung konzentriert und analysiert SDS-PAGE/immunoblotting wie zuvor 8 beschrieben.
- Die Menge der eluierten Lipidvesikel wird durch den Nachweis von Vybrant CM-DII (rosa) in der organischen (Chloroform / Methanol) Phase des Wessel Flügge Fällungsreaktion quantifiziert. Die Menge an Protein analysiert wird auf gleiche Mengen von Lipidvesikeln normalisiert.
3. Ergebnisse
LIMACS Reinigung von PKCζ-EGFP und die Ceramid-bindende Domäne C20ζ-EGFP
Ein Waschmittel-free Lysat von MDCK-Zellen, die in voller Länge PKCζ C-terminal in Verbindung mit grün fluoreszierende Protein (FLζ-EGFP) oder Ceramid-bindende Domäne in der C-Terminus von PKCζ (C20ζ-EGFP) wurde mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert beschrieben in experimentelle Verfahren. Nach der Elution der MACS-Säule wurde Protein analysiert mittels Immunoblot und Antikörper gegen PKCζ und EGFP für die Detektion der eluierten Protein 2.
Abbildung 1. LIMACS von EGFP-markierten PKCζ und seine C-terminale Fragment C20ζ mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel.
Waschmittel-free Lysaten von MDCK-Zellen, die EGFP (als eine unverbindliche Regelung), in voller Länge PKCζ-EGFP oder der Ceramid Bindung, C-terminale Fragment C20ζ-EGFP wurden mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben . Nach der Verwendung LIMACS, wurde Protein mit SDS-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE und Immunoblot. Die linke Tafel zeigt, dass EGFP nicht auf die Vesikel mit der Annexin V-linked magnetischen Kügelchen zurückgehalten zu binden. Die mittlere und rechte Bild zeigt die volle Länge PKCζ-EGFP und C20ζ-EGFP wurden durch die Bindung an Ceramid beibehalten.
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Discussion
Um zu testen, die spezifische Interaktion zwischen einem Lipid-und Protein wird durch die Einbettung von Lipiden in der Zellmembran behindert. Die Zellmembran besteht aus einer Mischung von mehreren Lipiden und Proteinen, und es ist in Lipid-Mikrodomänen oder Flöße organisiert. Daher kann die Co-Reinigung von Mikrodomänen und Proteine nicht klar unterscheiden, ob ein Protein direkt bindet an ein Lipid oder nur in einem Mikrodomänenstruktur bereichert. Andere Methoden anhand definierter Lipide auf Oberflächen wie Lipid-ELISAs oder Plasmon-Resonanz-Spektroskopie beschichtet werden können die Interaktion eines bestimmten Lipid mit seinem Bindungsprotein erkennen .. Doch um diese Wechselwirkung in einem physiologisch relevanten Membran Umwelt zu bestimmen, die Oberfläche (z. B. für Plasmon-Resonanz-Spektroskopie) hat mit Lipid-Vesikeln oder Liposomen beschichtet werden.
Wir entwickelten ein neuartiges Lipidvesikel Bindungsassay als Alternative zu diesen bisherigen Methoden. Die Neuheit kommt von Aufnahme eines Ankers Lipid (Phosphatidylserin) in den Vesikeln, die für die Isolierung von Lipid-Vesikel mit Annexin V-konjugierten magnetischen Beads ermöglicht. Daher bezeichnet man diesen Test Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS). LIMACS für endogene Proteine durchgeführt werden kann, rekonstituierten Proteine in Zellen oder rekombinante Proteine exprimiert in einer Lipid-Protein-Komplex 1-3.
Das Protein gebunden an die Lipid-Vesikel können dann, indem man einfach die MACS-Säule aus dem Magnetfeld stehen und eluting es mit einem geeigneten Puffer wiederhergestellt werden. Dies kann ein Enzym kompatibel Puffer, um die Enzymaktivität im Eluat oder SDS-Probenpuffer, um Protein-Analyse mit SDS-PAGE und Immunoblot durchführen zu messen. Bei Verwendung von SDS-Probenpuffer der MACS-Säule muss nicht von der magnetischen stehen, die für die Beibehaltung der magnetischen Kügelchen auf dem Stand ermöglicht entfernt werden.
Es gibt zu ergreifenden Vorsichtsmaßnahmen bei der Verwendung von LIMACS werden. Offensichtlich kann LIMACS nicht mit einem Waschmittel Lysat verwendet werden, da dies die Lipidvesikel zerstören wird. Außerdem hat es zu prüfen, ob dem Bindungsprotein des Ziels Lipid Phosphatidylserin bindet auch an, weil dieses Lipid als Anker für die Bindung der Vesikel an Annexin V-konjugierten magnetische Beads verwendet wird. . In einigen Fällen kann Phosphatidylserin beeinträchtigen die Bindung an das Zielprotein. Deshalb haben negative Kontrollen und Kontrollen mit verschiedenen Mengen von Phosphatidylserin in den Test eingeschlossen werden. Thesecontrols kann leicht durch Lipid-Vesikel, die nur Phosphatidylserin oder eine Mischung von Phosphatidylserin mit unverbindlichen Lipide durchgeführt werden. Inklusive negativen Kontrollen wird auch für Zelllysaten, dass eine erhebliche Menge an endogenen Phosphatidylserin enthalten erforderlich. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit endogenen Lipidmembranen oder Vesikel empfiehlt es sich, das Zelllysat durch die Aufnahme einer Ultrazentrifugation bei 100.000 xg klar für 1 h wird Es ist offensichtlich, dass Lipid-bindende Proteine im Überstand kann nur zytosolische, die eine Begrenzung der LIMACS Verfahren ist. Es besteht die Möglichkeit, LIMACS zu anderen Anker Lipide wie GM1 und Cholera-Toxin B-Untereinheit konjugiert mit magnetischen Beads zu verlängern.
Wir prüfen derzeit die Verwendung von Lipid-spezifische Antikörper für LIMACS, die machen den Einsatz von Anker-Lipide zur Herstellung der Vesikel unnötig wären. Einer der positiven Aspekte der LIMACS ist die Isolierung der Lipid-Protein-Komplex, die für eine Vielzahl von Protein-analytischen Methoden, die nicht umsetzbar ermöglicht .. Zum Beispiel haben wir LIMACS verwendet, um eine gebrauchsfertige Polarität Protein-Komplex von Par6/Cdc42 mit Ceramid gebunden aPKC assoziiert zu isolieren. Daher ist LIMACS eine leistungsstarke neue Methode für die Analyse und Isolierung von Lipid-associated Protein-Komplexen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt R01NS046835 und R01AG034389 und der March of Dimes gewähren 6FY08-322 unterstützt. Ein besonderer Dank an Frau Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), die enorm mit ihren Einsichten halfen in die MACS-Technologie gewidmet ist. Miltenyi hat großzügig das Material für die Demonstration der Experimente ohne Kosten verwendet werden, vorausgesetzt. Ich bin auch dankbar, dass Dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), die PKCζ exprimierende Zelllinien generiert. Unterstützung durch das Institut für Molekulare Medizin an der Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (unter Leitung von Dr. Lin Mei) ist ebenfalls anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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