Summary
अपने लक्ष्य लिपिड हम एमएसीएस और Annexin वि संयुग्मित चुंबकीय मोतियों और लिपिड लक्ष्य लिपिड और Annexin वि बाध्यकारी phosphatidylserine से संश्लेषित vesicles उपयोग के साथ एक प्रोटीन की बातचीत का परीक्षण. लक्ष्य लिपिड करने के लिए बाध्य प्रोटीन सह शुद्ध कर रहे हैं और मोती से elution बाद विश्लेषण.
Protocol
1. परिचय
लिपिड पुटिका की मध्यस्थता आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी चुंबकीय सक्रिय कक्ष (LIMACS) छँटाई तकनीक का उपयोग कर हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया था करने के लिए ceramide जुड़े प्रोटीन परिसरों को 1-3 अलग . मूलतः, लिपिड vesicles ceramide और phosphatidylserine, जो चुंबकीय कण संयुग्मित Annexin वी (अत्यधिक phosphatidylserine के लिए affine) का उपयोग करने के लिए vesicles और उनके जुड़े प्रोटीन को अलग एमएसीएस के लिए अनुमति दी किए गए थे. हम LIMACS तकनीक का इस्तेमाल किया है के लिए polarity ceramide जुड़े जटिल और कक्ष से ceramide बंधनकारी प्रोटीन के अलगाव के इन विट्रो पुनर्गठन में 3 lysates . LIMACS vesicles (उदाहरण के लिए, glycolipid specifc lectins या लिपिड एंटीबॉडी) के अलगाव के लिए अन्य बातचीत भागीदारों का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है.
2. प्रायोगिक प्रक्रिया
लिपिड vesicles और aPKCBinding Assays की तैयारी
- लिपिड vesicles phosphatidylserine (105 μg) और बड़े liposome 1,4-7 तैयारी के लिए संशोधित प्रक्रियाओं का पालन C16-ceramide (85 μg) equimolar मात्रा में सूखे मिश्रण से प्राप्त कर रहे हैं.
- लिपिड मिश्रण और फिर resuspended पुटिका 50 मिमी Tris / एचसीएल (7.5 पीएच) और 150 मिमी NaCl के मिलकर बफर के 100 μl में 1 घंटे के लिए sonicated.
- पुटिका 0.1 मिमी 2 MnCl साथ पूरक बफर के 300 μl जोड़ने के बाद, नमूने 4 बजे 20 मिनट के लिए 12,000 μ जी ° सी. पर centrifuged
- गोली (बड़े लिपिड vesicles) पुटिका बफर के 100 μl में resuspended है और 37 से कम 1 घंटे के लिए 1 diI - Vybrant मुख्यमंत्री के nmol के साथ incubated डिग्री सेल्सियस एमएसीएस जुदाई के बाद पुटिका अंश कल्पना करने के लिए. Vybrant मुख्यमंत्री - diI एक लाल फ्लोरोसेंट डाई विशेष रूप से लिपिड झिल्ली में शामिल है.
- एक डिटर्जेंट मुक्त सेल lysate / झिल्लीदार मलबे centrifugation द्वारा हटाने के द्वारा पीछा किया hypotonic बफर (10 मिमी Tris / एचसीएल और protease फॉस्फेट और inhibitors के साथ (7.0 पीएच)) के 300 μl में कोशिकाओं के homogenization sonication द्वारा तैयार की है. 1 ज के लिए 1,00,000 XG पर centrifugation कदम अंतर्जात phosphatidylserine युक्त झिल्ली के साथ सेल lysate के संक्रमण से बचने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
- मंजूरी दे दी lysate लिपिड पुटिका निलंबन के लिए जोड़ा जाता है, और मिश्रण 2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में incubated है
- प्रतिक्रिया मिश्रण 20x Annexin वी बाध्यकारी बफर और एक चुंबकीय मोतियों Annexin वी संयुग्मित युक्त समाधान के 50 μl के 20 μl के साथ पूरक है पर 1 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा
- एमएसीएस निर्माता (Miltenyi बायोटेक इंक) प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है. और लिपिड vesicles की उपस्थिति मात्रा Vybrant मुख्यमंत्री-diI प्रतिदीप्ति एक microplate प्रतिदीप्ति पाठक का उपयोग कर प्रवाह के माध्यम से और elution भागों में निगरानी के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- vesicular लिपिड की राशि और प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच रैखिक संबंध पुटिका बाध्य Vybrant मुख्यमंत्री diI मात्रात्मक Annexin वि आधारित एमएसीएस के लिए लागू लिपिड मिश्रण के उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (HPTLC) द्वारा सत्यापित है.
- ceramide / phosphatidylserine vesicles aPKC या अन्य प्रोटीन के बंधन प्रतिक्रिया की विशिष्टता एक एंटीबॉडी प्रतिस्पर्धा विरोधी PKCζ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का 1 μg का उपयोग कर के 4 में 1 घंटे के लिए सेल lysate सेते डिग्री सेल्सियस के साथ पूर्व ऊष्मायन के परख द्वारा सत्यापित है लिपिड vesicles.
- एमएसीएस eluate में / ceramide phosphatidylserine vesicles के लिए बंधनकारी प्रोटीन एसडीएस PAGE और immunoblotting से विश्लेषण किया है.
इन विट्रो polarity लिपिड प्रोटीन जटिल
- polarity लिपिड प्रोटीन परिसर के इन विट्रो पुनर्गठन में LIMACS प्रक्रिया का पालन के रूप में पिछले अनुभाग में वर्णित किया जाता है. संक्षिप्त (420 μg) phosphatidylserine और C16 ceramide (107 μg) में कार्बनिक विलायक से सूख रहा है.
- सूखे लिपिड sonication के तहत पुटिका बफर के 500 μl (, 150 मिमी NaCl 50 मिमी Tris / एचसीएल, 7.5 पीएच) में resuspended हैं.
- 10 मिमी MnCl2, Vybrant मुख्यमंत्री - diI 1 μl और PKCζ के 500 एनजी (पुनः संयोजक मानव) के पांच μl जोडी और प्रतिक्रिया मिश्रण 60 मिनट के लिए 4 पर undergentle आंदोलन incubated डिग्री सेल्सियस
- Vybrant मुख्यमंत्री diI दाग / phosphatidylserine ceramide vesicles centrifugation द्वारा 12,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए बरामद कर रहे हैं
- गोली (गुलाबी) 100 μl Tris बफर में resuspended है और (100 सुक्ष्ममापी) γS GTP, सकल घरेलू उत्पाद (1 मिमी), GST Par6 (100 एनजी), या जीएसटी Cdc42 (500 एनजी) के साथ पूरक और आगे 3 के लिए incubated 4 पर घंटे ° C (ब्याज की पुनः संयोजक प्रोटीन के किसी भी अन्य संयोजन का यहां इस्तेमाल किया जा सकता है) .
- Annexin वी (एक 20x शेयर समाधान के 5 μl) बफर और Annexin वि संयुग्मित चुंबकीय मोती (50 μl) और जोड़ रहे हैं प्रतिक्रिया मिश्रण 4 बजे एक 30 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए कोमल आंदोलन के तहत incubated
- Annexin वी एमएसीएस आपूर्तिकर्ता प्रोटोकॉल के रूप में पहले वर्णित के बाद किया जाता है. elution अंश (1 मिलीलीटर) वर्षण सहायता के रूप में शुद्ध ovalbumin के 10 μg के साथ पूरक है. प्रोटीन Wessel - Flugge वर्षण से ध्यान केंद्रित किया है और SDS-PAGE/immunoblotting के रूप में पहले 8 वर्णित विश्लेषण.
- eluted लिपिड vesicles की राशि Wessel Flugge वर्षण प्रतिक्रिया की जैविक चरण (क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल) में Vybrant मुख्यमंत्री diI (गुलाबी) का पता लगाने के द्वारा मात्रा निर्धारित है. विश्लेषण प्रोटीन की मात्रा लिपिड vesicles के बराबर मात्रा पर सामान्यीकृत है.
3. परिणाम
LIMACS PKCζ-EGFP की शुद्धि और ceramide बाध्यकारी डोमेन C20ζ-EGFP
MDCK पूरी लंबाई व्यक्त कोशिकाओं की एक डिटर्जेंट मुक्त lysate PKCζ सी - टर्मिनली phosphatidylserine / ceramide vesicles के साथ हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FLζ EGFP) या PKCζ (C20ζ-EGFP) सी टर्मिनस में ceramide बाध्यकारी डोमेन से जुड़े के रूप में incubated था प्रायोगिक प्रक्रिया में वर्णित है. एमएसीएस स्तंभ के elution के बाद, प्रोटीन immunoblotting और PKCζ और eluted 2 प्रोटीन का पता लगाने के लिए EGFP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया था.
चित्रा 1. LIMACS EGFP लेबल PKCζ और अपनी सी - टर्मिनल टुकड़ा C20ζ phosphatidylserine / ceramide vesicles का उपयोग .
MDCK EGFP (एक गैर बाध्यकारी नियंत्रण के रूप में), पूर्ण लंबाई PKCζ-EGFP, या ceramide बंधन, सी - टर्मिनल C20ζ-EGFP टुकड़ा व्यक्त कोशिकाओं के डिटर्जेंट से मुक्त lysates phosphatidylserine / ceramide vesicles के साथ incubated रहे थे के रूप में प्रायोगिक प्रक्रिया अनुभाग में वर्णित . LIMACS का उपयोग करने के बाद, प्रोटीन एसडीएस नमूना बफर के साथ eluted था और एसडीएस PAGE द्वारा विश्लेषण और immunoblotting. बाईं पैनल से पता चलता है कि EGFP Annexin वी से जुड़े चुंबकीय मोतियों के साथ बनाए रखा vesicles के लिए बाध्य नहीं किया है. मध्यम और सही पैनल है कि पूर्ण PKCζ-EGFP और C20ζ-EGFP कारण ceramide के लिए बाध्य बनाए रखा गया. लंबाई से पता चलता है
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Discussion
कोशिका झिल्ली में lipids की embedding द्वारा एक लिपिड और उसके बंधनकारी प्रोटीन के बीच विशिष्ट बातचीत का परीक्षण करने के लिए आड़े आती है. कोशिका झिल्ली कई lipids और प्रोटीन का एक मिश्रण के होते हैं और यह लिपिड microdomains या rafts में आयोजित किया जाता है. इसलिए, सह microdomains और प्रोटीन की शुद्धि स्पष्ट रूप से अगर एक प्रोटीन सीधे एक लिपिड को बांधता है या केवल एक microdomain संरचना में समृद्ध भेद नहीं कर सकते हैं. अन्य तरीकों का उपयोग कर परिभाषित लिपिड ELISAs या plasmon अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे सतहों पर लेपित लिपिड अपनी बंधनकारी प्रोटीन के साथ एक विशिष्ट लिपिड की बातचीत का पता लगा सकते हैं .. हालांकि, एक physiologically प्रासंगिक झिल्ली के माहौल में इस बातचीत का निर्धारण करने के लिए, (उदाहरण के लिए, plasmon अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए) सतह लिपिड vesicles या liposomes साथ लेपित हो गया है.
हम इन पिछले विधियों के लिए एक विकल्प के रूप में एक उपन्यास लिपिड पुटिका बाध्यकारी परख विकसित किया है. नवीनता vesicles, जो Annexin वि संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लिपिड vesicles के अलगाव के लिए अनुमति देता में एक लंगर लिपिड (phosphatidylserine) को शामिल करने से आता है. इसलिए, हम इस परख लिपिड आत्मीयता पुटिका की मध्यस्थता चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (LIMACS) का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी करार दिया. LIMACS अंतर्जात प्रोटीन के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है है, कोशिकाओं, या पुनः संयोजक प्रोटीन में व्यक्त प्रोटीन लिपिड प्रोटीन परिसर में पुनर्गठन 1-3 .
लिपिड vesicles के लिए बाध्य प्रोटीन तो बस स्टैंड से चुंबकीय एमएसीएस स्तंभ ले रही है और यह एक उपयुक्त बफर के साथ eluting बरामद किया जा सकता है. यह एक एंजाइम संगत eluate या एसडीएस नमूना बफर एसडीएस पृष्ठ का उपयोग और immunoblotting प्रोटीन विश्लेषण प्रदर्शन में एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए बफर जा सकता है. एसडीएस नमूना बफर का उपयोग यदि एमएसीएस स्तंभ चुंबकीय स्टैंड, जो स्टैंड पर चुंबकीय मोतियों की बनाए रखने के लिए अनुमति देता है से हटा दिया जाना नहीं है.
वहाँ सावधानियों जब LIMACS का उपयोग कर लिया जाना हैं. जाहिर है, LIMACS डिटर्जेंट lysate साथ उपयोग नहीं किया क्योंकि इस लिपिड vesicles को नष्ट कर देगा कर सकते हैं. इसके अलावा, यह अगर लक्ष्य लिपिड के बंधनकारी प्रोटीन भी phosphatidylserine को बांधता है, क्योंकि यह लिपिड vesicles Annexin वि संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य करने के लिए एक लंगर के रूप में प्रयोग किया जाता है परीक्षण किया जाना है. . कुछ मामलों में, phosphatidylserine लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य क्षीण कर सकते हैं. इसलिए, नकारात्मक phosphatidylserine के विभिन्न मात्रा के साथ नियंत्रण और नियंत्रण परख में शामिल किया जाना है. Thesecontrols लिपिड केवल phosphatidylserine या गैर बाध्यकारी lipids के साथ phosphatidylserine का एक मिश्रण युक्त vesicles का उपयोग करके आसानी से किया जा सकता है. सहित नकारात्मक नियंत्रण सेल lysates कि अंतर्जात phosphatidylserine का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल के लिए भी आवश्यक है. अंतर्जात लिपिड झिल्ली या vesicles यह 100.000 XG में एक ultracentrifugation कदम सहित एक एच. के लिए सेल lysate स्पष्ट अनुशंसा की जाती है के साथ संक्रमण से बचने के लिए यह स्पष्ट है कि सतह पर तैरनेवाला में लिपिड बंधनकारी प्रोटीन केवल साइटोसोलिक किया जा सकता है, जो LIMACS प्रक्रिया की एक सीमा है. GM1 और हैजा विष बी चुंबकीय मोतियों के साथ संयुग्मित सबयूनिट जैसे अन्य लंगर लिपिड LIMACS विस्तार की संभावना है.
वर्तमान में हम LIMACS के लिए लिपिड विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, जो vesicles की तैयारी के लिए लंगर lipids की अनावश्यक उपयोग करना होगा तलाश रहे हैं. LIMACS के लाभप्रद पहलुओं के एक लिपिड प्रोटीन जटिल है जो विश्लेषणात्मक तरीकों कि कार्यान्वयन नहीं कर रहे हैं प्रोटीन की एक किस्म के लिए अनुमति देता है के अलगाव है .. उदाहरण के लिए, हम LIMACS का इस्तेमाल किया है Par6/Cdc42 का पुनर्गठन polarity प्रोटीन जटिल ceramide बाध्य aPKC के साथ जुड़े अलग. इसलिए, LIMACS लिपिड जुड़े प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण और अलगाव के लिए एक शक्तिशाली उपन्यास विधि है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच R01NS046835 अनुदान और R01AG034389, और मार्च ऑफ डाइम्स 6FY08 322 अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था. एक विशेष धन्यवाद आप श्रीमती Eleanor (Miltenyi बायोटेक, Auburn, CA) भूरी जो उसके अंतर्दृष्टि के साथ काफी एमएसीएस प्रौद्योगिकी में मदद करने के लिए समर्पित है. Miltenyi उदारता के प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए कोई भी कीमत पर सामग्री का इस्तेमाल किया प्रदान की है. मैं भी डॉ. Guanghu वैंग (/ जॉर्जिया जॉर्जिया स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय, Augusta के मेडिकल कॉलेज, GA) जो सेल लाइनों को व्यक्त PKCζ उत्पन्न करने के लिए आभारी हूँ. जॉर्जिया / जॉर्जिया स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय (डॉ. लिन मेई के निदेशक के तहत) के मेडिकल कॉलेज में आण्विक चिकित्सा के संस्थान द्वारा समर्थन भी स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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