תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Summary

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

Abstract

לאחר העיכול, הריאות הוא השטח השני בגודלו עבור האינטראקציה בין הגוף חוליות ואיכות הסביבה. הנה, חילופי גז יעיל חייבת להישמר, ואילו באותו זמן הימנעות זיהום על ידי פתוגנים רבים כי הם נשאפים במהלך נשימה רגילה. כדי להשיג זאת, סט מעולה של אסטרטגיות ההגנה שילוב מנגנוני החיסון הלחות ואת הסלולר קיים. אחד האמצעים היעילים ביותר להגנה אקוטית של הריאות הוא גיוס של נויטרופילים, אשר גם phagocytose פתוגנים בשאיפה או להרוג אותם על ידי שחרור חומרים כימיים ציטוטוקסיות. בנוסף האחרונים לארסנל של נויטרופילים הוא לשחרר נפץ שלהם NETS תאי ה-DNA על ידי חיידקים או פטריות, אשר יכול להיתפס או מומת גם לאחר שחרור התאים NET מתו. אנו מציגים כאן שיטה המאפשרת להתבונן ישירות אחד נויטרופילים, נודדים בתוך ריאה נגועה לאחרונה, phagocytosing פתוגנים ופטריות כמו גם לדמיין את NETS נרחב שהם יצרו לאורך הרקמה הנגוע. השיטה מתארת ​​את הכנת פרוסות עבות ריאות קיימא 7 שעות לאחר ההדבקה intratracheal של עכברים עם conidia של העובש אספרגילוס fumigatus ובדיקה שלהם על ידי מיקרוסקופ ססגוניות 2-פוטון זמן לשגות. גישה זו מאפשרת לנו לחקור ישירות הגנה נגד פטריות ברקמת הריאה יליד ובכך פותח דרך חדשה עבור החקירה מפורט של חסינות ריאתי.

Protocol

1. זיהום

1. Conidia נפיחות של העובש אספרגילוס fumigatus (זן ATCC 46,645) מופקים על ידי הדגירה טרום ב RPMI 1640 (Biochrom AG, ברלין, גרמניה), בתוספת 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ conidia מנוחה הם resuspended בינוני 5 מ"ל ו מודגרות בתוך צלחת 6-היטב רקמות תרבות (TPP AG; Trasadingen, שוויץ, קטלוג # 92006) עבור 7h על 37 ° C.
2. בעקבות התקופה נפיחות, הנבגים הם שכותרתו fluorescently ידי הוספת 10 μl של פתרון לבן המניות calcofluor (סיגמא אולדריץ', Deisenhofen, גרמניה, קטלוג # F3543; [25 מ"ג / מ"ל] ב DMSO) לכל אספרגילוס המכיל היטב 6-היטב צלחת, והגיע ריכוז סופי calcofluor של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RPMI. לאחר ערבוב עדין, הנבגים מודגרת 15 דקות נוספות ב 37 ° C.
3. בשלב הבא, הנבגים נקצרים על ידי סינון דרך תא 70 מיקרומטר מסננת (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). אחרי כביסה אחת עם 10 מ"ל PBS (צנטריפוגות ב 900xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר) היא גלולה resuspended ב 2 מ"ל PBS ואת המספר הכולל של conidia נפוחות נקבע על ידי ספירה עם תא Neubauer. לבסוף ההשעיה נבג הוא הסתובב לעבר 900xg 5 דקות בטמפרטורת החדר, supernatant הוא הסיר בזהירות, גלולה resuspended הריכוז הסופי של 1x107 נבגים ל -100 μl PBS.
4. עבור זיהום, 100 μl של פתרון נבג מוחל intratracheally לעכברים הנשי (C57/BL6, 8-10 שבועות, הארלן, גרמניה). אם נויטרופילים יש לצפות גם השימוש ליס-EGFP עכברים, נושאת EGFP תחת promotor ליזוזים ¹ מומלץ. בגין על ידי הרדמה החיה עם זריקה IP יחידה של פתרון 150 Ketamin / Rompun μl (Inresa Arzneimittel GmbH, פרייבורג, גרמניה (Ketamin) ו באייר ויטל GmbH, לברקוזן, גרמניה (Rompun), 1 מ"ל Ketamin [50 מ"ג / מ"ל] + 0.5 מ"ל Rompun [2%] + 3.5 מ"ל סטרילי NaCl [0.9%]). 5 דקות מאוחר יותר העכבר הרדים יכול להיות קבוע עם גומייה על ידי השיניים שלה הרמפה (כלומר, משטח משופע) כדי להקל על אינטובציה (דמות משלים 1). בעזרת מלקחיים, הלשון היא משכה הצידה צנתר ורידי 22g שכינת (B. Braun AG, Melsungen, גרמניה, Vasofix Braunüle) יכול להיות מוכנס בעדינות תחת תאורה קבועה עם מנורה צוואר אווז לתוך קנה הנשימה. הכניסה המוצלחת של הקטטר מאומת על ידי התבוננות תנועה סדירה של בית החזה של החיה עם תדירות ההנשמה המכני. כאשר אינטובציה מוצלחת אושרה, 100 ההשעיה נבג μl מיושמת באמצעות micropipette 100 μl. נפח זה צריך להיות בשאיפה ידי החיה ללא כל עזרה נוספת 1-2 s. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני החיה הנגועים במשך 2 דקות עם הנשמה חיה קטנה (MiniVent, הוגו סאקס, מארס Hugstetten, גרמניה) בשיעור של 250 נשימות בדקה ואת נפח שאיפה של 300 μl לכל נשימה (דמות משלים 2). אחרי החיות זיהום מוחזר לכלוב שלהם נצפו כל 5 דקות עד אמבולטורי שוב. עכברים לא מראים כל עדות של כאב או מצוקה במהלך תקופת הדגירה הבאה.

2. ריאות הכנה

1. 7 שעות לאחר ההדבקה עם הנבגים, בעל החיים מורדמים ממנת יתר של isoflurane (בקסטר GmbH, Unterschleiβheim, גרמניה) עד תנועות נשימה הפסיקו במשך יותר מ 30 שניות. זהו לאחר מכן על ידי פתיחת בית החזה כשיטה משנית להבטיח מוות קליני ולאפשר גישה להדמיה של קנה הנשימה והריאות. ואז החזה נפתח בזהירות כדי לחשוף את הריאה ואת דרכי הנשימה העליונות. ואז צנתר ורידי אחר 22g שכינת מוכנס לתוך קנה הנשימה החל מכסה הקנה חשוף. דרך אבובית זה הריאות מלאים 1 מ"ל מראש חימם ההיתוך agarose נמוכה (2% w / v, Promega, מנהיים, גרמניה) באמצעות מזרק 1 מ"ל Omnifix (B. Braun). ברגע לריאות מלאים קנה הנשימה נקשר עם חתיכת קצר של חוט תפירה החי כולו מוכנס לתוך מקרר ב -4 ° C.
2. 15 דקות מאוחר יותר, כאשר agarose יש הקרושה, הריאה כולה הוא נכרת החל לקנה הנשימה. בעזרת מספריים מחודדות, האונה ריאה ימין מוסרת לאחר מכן, על פני השטח התחתונה היא מיובשים בקצרה על דף נייר, ואז כל האונה מודבק לחסום את הכנת (Campden מכשירים, בריטניה, vibratome 752M Vibroslice ) באמצעות טיפת דבק רקמות עבור קיבעון (קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה, רוטי, קול 1). לאחר דקות 1 לחסום את מותקן בתא החנית של vibratome, אשר מלא מראש מצונן (4 ° C) PBS. Vibratome מוגדר רטט אמצע טווח (5 מתוך מקסימום 10.) וגם מהירות בינונית (5 מתוך מקסימום 10). כזה חתך אופקי שלריאה מיוצר. החצי העליון של האיבר הוא הועבר לאחר מכן לתוך פלסטיק קטן צלחת פטרי (5 ס"מ קוטר), שם הוא הפוך וקבוע עם מכונת כביסה מתוצרת עצמית שטוח (1 ס"מ קוטר פנימי), כי הוא מכוסה על ידי קבוצה של חוטי ניילון במקביל, כל 1 מ"מ זה מזה (איור משלים 3). לבסוף צלחת פטרי מלא 10 מ"ל PBS בתוספת 10 μl של צבע DNA Sytox אורנג' [5 mM] (Invitrogen, גרמניה) וכתוצאה מכך ריכוז צבען הסופי של 5 מיקרומטר.

3. 2-פוטון לייזר מיקרוסקופיה

1. צלחת פטרי שמכילה את דגימת הריאות מותקן ולאחר מכן, תחת המטרה מיקרוסקופ כך החיץ ניתן לחמם 37 ° C על ידי חיישן טמפרטורה שבשליטת דוד (דמות משלים 4). 2-פוטון מיקרוסקופית נישא החוצה על פני השטח חתך שלם באמצעות LSM Zeiss 710 מיקרוסקופ NLO על הבמה זקוף בוחן Axio מצויד בעדשה 20xNA1.0 מים טבילה (Zeiss, Jena, גרמניה). עבור הדמיה, אזורים שונים לאורך הקטע נסרקים עד לעומק 400 מיקרומטר באמצעות גל של 800 ננומטר תאורה גילוי ירוק (530 ננומטר) אדום (580 ננומטר) הקרינה, כמו גם את הדור הרמוני השני (SHG) אות ו כחול calcofluor הקרינה (על פליטת 400-470 ננומטר) עם גלאים חיצוניים שאינם descanned (NDD). מלבד 2-D תמונות זמן לשגות סרטים (1 תמונה כל 50-10 שניות), יחיד או חוזרות 3 מימדי ערימות תמונה ניתן לעבד לאחר מכן כמו renderings voxel יחיד או תמונות מוקד המורחבת או 4-D נתונים (3D לאורך זמן) באמצעות חבילות תוכנה שונות. זו ההגדרה המיקרוסקופית מאפשרת תצפית על התנהגות הסלולר בסביבה כמעט ללא פגע, כפי שהיא מהווה נמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, הוא הרלוונטיות החיסונית עצום. תנועתיות התא, phagocytosis ייצור NET ידי נויטרופילים זיהום אנדוגני הבאים עם עובש אספרגילוס fumigatus ניתן לחקור בקלות בתנאים באתרו תחת אלה.

4. נציג תוצאות

אם נעשה כראוי הדמיה יפיק 2 - או 3 צבעים שקופיות או סרטים. למרות צביעה נעשה בהליך עיבוד פוסט ועל כן להתאמה בחופשיות, אנחנו בדרך כלל לבחור ערכת צביעה המשקף את הצבע הטבעי של צבע / אות, אשר מזוהה בערוץ יחסית. לפיכך, צבעי Sytox מתוארים אדום, פטריות, כמו גם את האות SHG מוצג כחול, אם קיימת, EGFP שכותרתו תאים מוכתמות בירוק. בדוגמה הראשונה (איור 1) את האות SHG כחול מתאר את סיבי רקמת הריאה הלא נגועים לבין האות אדום Sytox מופק על ידי גרעין של הריאה תושב תאים יחתכו אותי vibratome. בדוגמה השניה (איור 2) הריאות נגוע מוצג, שם שניהם, מבנים מכתשיים כמו גם ההמונים פטרייתי, יופיעו בכחול, בעוד הגרעינים ורשתות מוכתמות באדום. הדוגמה השלישית (איור 3) היא מבעל חיים מהונדס ליס-EGFP שבו בנוסף למבנים כחול ואדום נויטרופילים ירוק ניתן גם לראות. הגירה של נויטרופילים phagocytosis שלהם אלמנטים פטרייתי בודדים רצפי זמן לשגות מוצג בסרט משלים.

באיור 1. המראה של פרוסת שאינם נגועים ריאה בצבע-2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאות הוכן מתוך עכבר C57/BL6 הלא נגוע צילמו כמפורט בפרוטוקול. מתפרסמות כאן את האות SHG של מבנה רקמות מכתשיים (א), את האות Sytox של גרעיני תאים לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C). שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד '). שימו לב רקמה סיבית בחלק התחתון של הריאות פרוסה לעומת הארגון מכתשיים בבירור בתוך נשימה פעיל בתחומים של הריאה לעיל.

איור 2. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע מסוג אספרגילוס בר צבע 2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאה מן העכבר C57/BL6 נגוע 7 שעות לפני כן עם א ' fumigatus הוכן צילמו כמפורט בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי בשילוב SHG של הרקמה מכתשיים (א), את האות Sytox של רשתות ה-DNA, כמו גם גרעין התא לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C) . שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד '). לידיעתך, באזורים שונים בבירור ההמונים פטרייתי, alveoli, ו-NET המבנים המסומנים באותיות, F ו-N, בהתאמה.

איור 3. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע ליס-EGFP אספרגילוס בצבע 3 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת הריאות של עכבר ליס-EGFP נגוע 7 שעות לפני עםא fumigatus הוכן צילמו כמתואר בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי SHG בשילוב של רקמות מכתשיים (כחול), את האות Sytox של גרעיני תאים ורשתות (אדום), וכן גם נויטרופילים רבים (ירוק).

משלימה דמות 1. קיבעון עכבר עבור אינטובציה. תחת הרדמה Ketamin / Rompun החיה קבוע עם גומייה על השיניים שלה כדי להקל על אינטובציה עם צנתר ורידי שכינת 22g.

משלימה דמות 2. עכבר אוורור מכני. העכבר צנרר נגוע על ידי יישום זה של ⁷ נבגים 1x10 resuspended ב 100 μl PBS. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני העכבר נגוע הנשמה חיה קטנה.

משלימה דמות 3. האונה ריאות קיבעון. לאחר הכנה של האונה הימנית איבר הריאות הוא קבוע בצלחת פטרי על ידי שימוש מכונת כביסה שטוח מעבדה מתוצרת כי הוא מכוסה על ידי מערכת של חוטי ניילון במקביל.

משלימה דמות 4. 2-פוטון ההתקנה הדמיה. צלחת פטרי שמכילה את האונה ריאה ימין מותקן על מחצלת חימום תחת מיקרוסקופ 2-הפוטון לאחר תוספת של ה-DNA Sytox צבע כתום.

הסרט משלים:. נויטרופילים נויטרופילים נודדות phagocytosing אלמנטים פטרייתי בריאות אספרגילוס נגוע כפי שניתן לראות על ידי זמן לשגות 2-פוטון מיקרוסקופית של h חי פלח 7 ריאות לאחר ההדבקה עם הפטרייה הם ירוק, פטריות מרכיבים SHG הם כחול, גרעיני תאים כמו גם NET-המבנים מתוארים אדום. השעה האמיתית של הניסוי מוצג בפינה הימנית התחתונה. סרגל מידה מתאר 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

Discussion

בזמן אמת 2-פוטון מיקרוסקופית in vivo או באיברים שלמים צברה חשיבות רבה במחקרים העוסקים הפיזיולוגיה של תאים חיסוניים במהלך 10 השנים האחרונות. זה היה עם הטכניקה הזו, כי אירועים חשובים כמו הדינמיקה של הפעלת תא T בתוך בלוטות הלימפה הראשון הפך גלוי ^2-4. לאחרונה, חוקרים החלו גם לנתח פונקציות סלולריות ספציפיות כמו הצעדים הראשונים בדור מפעיל תאים ברקמות הלימפה שימוש בגישה זו ^5.

עם זאת, למרות מספר מושגים ביולוגיים חדשים נחשפו באמצעות שיטה זו, ישנם עדיין מאתגרת שאלות חשובות עבורו אין מחקרים להדמיה intravital פורסמו עד כה. יש לציין כי זו חלה על הריאות של יונקים. ההיבט המעניין של האיבר הזה, כנמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, עושה את זה אחד המשטחים החשוב ביותר שבו תהליכים מתרחשים החיסונית בגופם של יונקים. עם כל נשימה על תוחלת החיים, חלקיקים לא רצויים הם נשאפים שבחלקם יש פוטנציאל לגרום לזיהומים מסכני חיים ^6. זה מובן מאליו כי במקום כה רגיש וסיכנו רשת הדוקה של מנגנוני הגנה צריך להיות נוכח מציג את רפרטואר שלם של המערכת החיסונית. מצד שני זה מאוד חשוב שהמאבק החיסונית הנגרמת נגד פתוגנים פוטנציאליים מקום כזה "מלוכלך" נתונה לפיקוח הדוק. תגובות מוגזמות של המערכת החיסונית לשאת בסיכון גבוה של פגיעה בגופו על ידי פציעה של רקמות איבר מאסיבי על גירוי של תא החיסון נוקבים פעולות ^7,8.

לאור המחשבות האלה זה יהיה מעניין מאוד מועיל יש את האפשרות לחקור את התנהגות התא בריאות יונקים תחת נכון בתנאים vivo. עם זאת, העובדה כי מערכת כזו עד כה לא יושמו בהצלחה בבירור מצביע על הקשיים העצומים שיש לפתור בהקמת פרוטוקול עבודה. האתגר התובעני ביותר כנראה הוא יציבות להתמקד. הריאות כגוף האחראי על הנשימה תחת תנועה מתמדת בכל שלושת הכיוונים של מרחב לממש שאיפה. תנאי זה לבד גורם לבעיות הדמיה חמורים יכולים להיחשב imagers intravital "סיוט". כבר תנועה קלה מימד בחלל יש השפעה מסיבית על הידרדרות להציג את מיקרוסקופיים, אשר צריך להיות יציב עם דיוק מיקרומטר על מנת להפיק תמונות בעלות משמעות ^9. בהתחשב להתמקד הדוק מטבעו שלה המקומיות ^10, 2-פוטון מיקרוסקופית הוא אפילו רגיש יותר אי יציבות מוקד, כמו פריקה של מבנה מסוים בטווח של רק כמה מיקרומטרים בכיוון-Z שווה לאובדן מלא של המוקד ובכך הניסוי נכשל.

פרוטוקול שהוצג במחקר זה לצורך השגחה של תאים חיסוניים בתוך הריאה Murine עדיין לא ביישום vivo, אלא הערכה קרובה למצב ריאה שלם מבחינה תפקודית ^11. גישות Ex vivo עבור לימפוציטים הדמיה, למשל הלימפה explanted צמתים, הוכחו להניב תוצאות שוות ערך אמיתי תצפיות vivo ¹² וכך הן רלוונטיות מאוד ^5. בתצפיות באתרם פרוסות ריאה, אשר אפשרי רק עם הגישה שלנו, יתקיים ריאות נגוע זמן קצר לאחר כריתה. שלמות 3D בתהליך חיתוך מובטחת על ידי מטריקס agarose, צעד חיוני כדי לאפשר תהליך חיתוך מבוקר בדיוק של הריאה. אמנם יש צורך לקרר את הריאות explanted לתקופה קצרה כדי לאפשר התמצקות של מטריקס agarose, ניתן לחזור בתנאים פיסיולוגיים ליד עבור תאים לאחר חיתוך rewarming של הרקמה. זו מוצגת בבירור הנתונים שלנו, אשר מראים כי בתנאים אלה נויטרופילים פעילים מאוד ולהציג את מלוא הפוטנציאל שלהם כמו phagocytes זריז, אשר נחוצים פינוי יעיל של זיהום Aspergillus fumigatus. הם מפטרלים רקמת הריאה עובר דרך אפיתל מחסומים כדי להגיע לחלקים הפנימיים של alveoli פעיל יתר על כן הם תופסים נבגי פטריות 11. ממצא מרכזי של עבודה זו הייתה הופעתו של מבנים דומים מלכודות תאי נויטרופילים (סלים) של אספרגילוס האיבר הנגוע. NETS הם ממצא האחרונות מאוד של הרומן מנגנון הגנה נויטרופילים ^13. עם זאת, מאז הדיווח הראשוני שלה בשנת 2004, מספר מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים או בני אדם שבו התופעה נצפתה או חסר כבר בפיצוץ הגדלת ^14-16. מעניין לציין, כי כל כך הרבה עבודה כבר בילה על מבנים אלה על ידי קבוצות רבות ושונות כל כך, רוב הדיווחים הם עדיין ברמה תיאורי מאוד ולא הרבהידוע על מנגנון של שחרור NET ורגולציה שלה. עם פרוטוקול שלנו הצלחנו בפעם הראשונה כדי להראות סיבים NET בריאה נגוע. יתר על כן, אנחנו יכולים להדגים את החשיבות של נויטרופילים גייס טרי, כמו גם מבנים מולקולריים פטרייתי עבור המופע שלהם או עיכוב ^11. זה מראה בבירור את הפוטנציאל של השיטה שלנו כדי לחקור את אחד השלבים של היווצרות NET ביתר פירוט. אפשר לחשוב למשל להשתמש נויטרופילים מעכברים מתאים עקום החוצה כדי לבחון את יכולתם של היווצרות NET בניסויים העברת המאמצת.

לכן, למרות תצפית ישירה של העלייה נויטרופילים מן הדם ההיקפיים אינו אפשרי עם המערכת הזו בשל חוסר אספקת דם לאחר explantation איברים, אנחנו עדיין מאמינים כי פרוטוקול שלנו היא גישה יקר יחסית קל לטפל המאפשר הדמיה של צעדים מוקדם או מאוחר בהגנה החיסונית כנגד דלקות ריאה. זהו, אפוא, צעד חשוב לקראת חוקרת את התופעה בתוך הריאות בנשימה של בעלי חיים.