A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Summary

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

Abstract

Após o trato gastrointestinal, o pulmão é o segundo maior superfície para a interação entre o corpo de vertebrados e meio ambiente. Aqui, efetiva troca gasosa deve ser mantida, enquanto, ao mesmo tempo evitar a infecção pelos patógenos múltiplos que são inalados durante a respiração normal. Para conseguir isso, um conjunto soberbo de estratégias de defesa humoral e celular combinando mecanismos imunes existe. Uma das medidas mais eficazes para a defesa agudo de pulmão é o recrutamento de neutrófilos, que fagocitam os agentes patogénicos ou inalados ou matá-los, liberando substâncias químicas citotóxicas. A recente adição ao arsenal de neutrófilos é a sua liberação explosiva de DNA extracelular-NET por bactérias ou fungos que podem ser capturados ou inativados, mesmo após a liberação de células NET morreram. Apresentamos aqui um método que permite observar diretamente os neutrófilos, migração dentro de um pulmão recém-infectados, phagocytosing patógenos fúngicos, bem como visualizar a NET extensa que eles têm produzido ao longo do tecido infectado. O método descreve a preparação de espessura de pulmão viável sete horas após a infecção intratraqueal de camundongos com conídios de Aspergillus fumigatus e seu exame pelo multicolor de lapso de tempo de microscopia 2-fótons. Esta abordagem permite investigar diretamente defesa antifúngica no tecido pulmonar nativo e, assim, abre um novo caminho para a investigação detalhada de imunidade pulmonar.

Protocol

1. Infecção

1. Conídios inchados de Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) são gerados por pré-incubação em RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Alemanha), suplementado com 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ conídios de descanso são ressuspendido em 5 ml de meio e incubados em uma placa de cultura de tecidos bem-6 (TPP AG; Trasadingen, Suíça, catalogo 92.006) por 7h a 37 ° C.
2. Após o período de inchaço, os esporos são fluorescente etiquetado, adicionando 10 ml de solução estoque calcofluor branco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemanha, catalogo F3543; [25 mg / ml] em DMSO) a cada um contendo Aspergillus bem no 6-bem placa, atingindo uma concentração calcofluor final de 50 mcg / ml RPMI. Após a mistura suave, os esporos são incubados por um adicional de 15 min a 37 ° C.
3. Na próxima etapa, os esporos são colhidas por filtração através de um filtro de 70 mM de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Depois de lavar uma vez com 10 ml de PBS (centrifugue a 900xg por 5 min à temperatura ambiente), o pellet é ressuspendido em 2 ml de PBS, eo número total de conídios inchados determinada contando com uma câmara de Neubauer. Finalmente, a suspensão de esporos é girada para baixo em 900xg por 5 min à temperatura ambiente, o sobrenadante é cuidadosamente removido eo pellet ressuspenso para a concentração final de 1x107 esporos por 100 mL de PBS.
4. Para a infecção, 100 ml de solução de esporos é aplicada intratraqueal em camundongos fêmeas (C57/BL6, 8-10 semanas de idade, Harlan, Alemanha). Se os neutrófilos são a serem observados, bem como, o uso de Lys-EGFP ratos, levando EGFP sob o promotor lisozima ¹ é recomendado. Comece por anestesiar o animal com uma injeção única de 150 ip solução cetamina / Rompun mL (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemanha (cetamina) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha (Rompun), 1 ml cetamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril NaCl [0,9%]). 5 minutos mais tarde o rato anestesiado pode ser fixado com um elástico pelos seus dentes para a rampa de acesso (ou seja, uma superfície inclinada) para facilitar a intubação (suplementar figura 1). Utilizando uma pinça, a língua é puxada para um lado e um cateter venoso 22G habitação (B. Braun AG, Melsungen, Alemanha, Vasofix Braunüle) pode ser gentilmente inserido na traquéia sob iluminação permanente com uma lâmpada no pescoço de ganso. A inserção bem sucedida do cateter é verificada pela observação movimento regular do tórax do animal com a freqüência do ventilador mecânico. Quando a intubação sucesso foi confirmado, 100 mL de suspensão de esporos é aplicado utilizando uma micropipeta 100 ul. Este volume deve ser inaladas pelo animal, sem qualquer ajuda adicional em 1-2 s. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica do animal infectado por 2 minutos com um respirador para pequenos animais (MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Alemanha) a uma taxa de 250 respirações por minuto e um volume de inalação de 300 mL por respiração (suplementar figura 2). Após a infecção os animais são devolvidos às suas gaiolas e observados a cada 5 minutos até ambulatorial novamente. Camundongos não mostram qualquer evidência de dor ou sofrimento durante o período de incubação seguinte.

2. Preparação de pulmão

1. 7 h após a infecção com os esporos, o animal é sacrificado por uma overdose de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemanha), até os movimentos ea respiração cessaram há mais de 30 segundos. Esta é seguida por toracotomia como um método secundário para garantir a morte clínica e permita a visualização e acesso da traquéia e pulmões. Em seguida, o peito é cuidadosamente abriu para expor o pulmão e do trato respiratório superior. Em seguida, outro cateter venoso 22G habitação é inserido na traquéia a partir da epiglote expostos. Através deste túbulo os pulmões são preenchidos com 1 ml pré-aquecido baixa temperatura de fusão agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemanha), utilizando uma seringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Assim como os pulmões estão cheios da traquéia é amarrado com um pequeno pedaço de fio de costura e todo o animal é colocado em um refrigerador a 4 ° C.
2. 15 min depois, quando a agarose solidificou, todo o pulmão é extirpado início da traquéia. Usando um par de tesouras afiadas pontas, o lobo do pulmão direito é posteriormente removido, a superfície inferior é brevemente secos em uma folha de papel de seda e, em seguida, o lobo inteiro está colado ao bloco de preparação de um (Campden Instruments, Reino Unido, vibratome 752M Vibroslice ), utilizando uma gota de cola de tecido para fixação (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha, Roti-Coll 1). Após 1 min o bloco é instalado na câmara de corte do vibratome, que é preenchido com pré-refrigeradas (4 ° C) PBS. O vibratome é definida como uma vibração mid-range (5 out of 10 max.) E também a velocidade moderada (5 out of 10 max.) Tal que uma seção transversal horizontal dade pulmão é produzido. A metade superior do órgão é então transferido para uma pequena placa de Petri de plástico (5 cm de diâmetro) onde ele é invertido e fixada com uma máquina de lavar self-made plana (1 cm de diâmetro interno) que é coberta por um conjunto de fios de nylon paralelos, cada 1 mm de distância (figura suplementar 3). Finalmente a placa de Petri é preenchido com 10 ml de PBS suplementado com 10 ml do corante DNA Sytox Orange [mM 5] (Invitrogen, Alemanha), resultando em uma concentração final de 5 mM de corante.

3. 2-fótons microscopia a laser

1. Placa de Petri contendo a amostra de pulmão é, então, instalado sob a objetiva do microscópio para que o buffer pode ser aquecido a 37 ° C por um sensor de temperatura controlada aquecedor (suplementar figura 4). 2-fótons de microscopia é então realizada sobre a superfície de corte inteira usando um microscópio Zeiss LSM 710 NLO em uma posição vertical estágio Examiner Axio equipada com uma lente de água 20xNA1.0 dipping (Zeiss, Jena, Alemanha). Para geração de imagens, diferentes áreas ao longo da seção são digitalizados para 400 M de profundidade usando um comprimento de onda de 800 nm iluminação detectar verde (530 nm) e vermelho (580 nm) de fluorescência, bem como a geração de segundo harmônico (SHG) de sinal eo azul calcofluor fluorescência (emissão de 400-470 nm), com detectores externos não descanned (NDD). Além de 2-D imagens e filmes lapso de tempo (1 imagem a cada 5-10 segundos), único ou repetitivo stacks 3-dimensional da imagem pode ser posteriormente processado como renderings voxel ou simples imagens foco estendido ou 4-D de dados (3D ao longo do tempo), utilizando pacotes de software diferentes. Esta configuração microscópica permite a observação do comportamento celular em um ambiente quase intacta que, uma vez que constitui a porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, é de relevância imunológica enorme. Motilidade celular, fagocitose e produção endógena NET por neutrófilos após a infecção com o molde Aspergillus fumigatus pode ser facilmente investigada sob essas condições in situ.

4. Resultados representante

Se feito corretamente a imagem irá gerar 2 - ou 3 cores slides ou filmes. Apesar de coloração é feita em um procedimento pós-processamento e é, portanto, livremente adaptável, que geralmente selecionar um esquema de cores que reflecte a cor natural do corante / sinal, que é detectado no canal relativa. Assim, os corantes Sytox são retratados em vermelho, o fungo, assim como o sinal de SHG é mostrado em azul e, se presente, EGFP marcado células são coradas em verde. No primeiro exemplo (Fig. 1) o sinal de SHG azul retrata as fibras do tecido de um pulmão de não-infectados e o sinal vermelho Sytox é produzida por núcleos de células do pulmão residente na corte aberto pela vibratome. No segundo exemplo (Fig. 2) um pulmão infectado é mostrado, onde ambas as estruturas, alveolar, assim como massas fúngicas, aparecem em azul, enquanto núcleos e redes são manchados de vermelho. O terceiro exemplo (Fig. 3) é de um animal transgênico Lys-EGFP onde para além das estruturas de azul e vermelho os neutrófilos verde também pode ser visto. A migração de neutrófilos e sua fagocitose de elementos individuais de fungos em sequências de lapso de tempo é mostrado no filme suplementar.

Figura 1. A aparência de uma fatia de pulmão de não-infectados em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão foi preparado a partir de um não-infectados C57/BL6 mouse e fotografada, como descrito no protocolo. Aqui apresentados são o sinal de SHG da estrutura do tecido alveolar (A), o sinal Sytox de núcleos celulares cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C). A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor, anote o tecido fibroso na parte inferior do pulmão fatia em comparação com a organização claramente alveolar nas áreas de respiração ativa do pulmão acima.

Figura 2. A aparência de uma fatia de pulmão de um animal do tipo Aspergillus selvagens infectadas em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão de um rato infectado C57/BL6 7 h antes com A. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (A), o sinal da NET Sytox DNA, bem como núcleos de células cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C) . A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor note, as áreas claramente distintas das massas fúngicas, alvéolos, e NET-estruturas são marcadas com as letras F, A e N, respectivamente.

Figura 3. A aparência de uma fatia de pulmão de uma pessoa infectada Aspergillus animais Lys-EGFP em 3 cores microscopia 2-fótons. Uma fatia de pulmão de um rato Lys-EGFP infectou 7 h antes comA. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (azul), o sinal Sytox de núcleos celulares e redes (vermelho), bem assim como diversos neutrófilos (verde).

Suplementar figura 1. Fixação do mouse para a intubação. Sob cetamina / Rompun anestesia do animal é fixa com um elástico em seus dentes, a fim de facilitar a intubação com cateter 22G habitação venoso.

Suplementar figura 2. Ventilação mecânica do mouse. O mouse intubados está infectado por um aplicativo que de 1x10 ⁷ esporos ressuspenso em 100 mL de PBS. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica o rato infectado com um respirador para pequenos animais.

Suplementar figura 3. Fixação do pulmão do lóbulo. Após a preparação do lobo do pulmão direito o órgão é fixado em uma placa de Petri pelo uso de uma arruela de laboratório feitos plana que é coberto por um conjunto de fios de nylon paralelos.

Suplementar figura 4. 2-fótons de configuração de imagem. A placa de Petri contendo o lobo do pulmão direito é instalado sobre um tapete de aquecimento sob o microscópio dois fótons após a adição do corante DNA Sytox Orange.

Filme suplementar:. Neutrófilos Os neutrófilos que migram e phagocytosing elementos fúngicos nos pulmões Aspergillus infectados visto por lapso de tempo de 2 fótons de microscopia de um pulmão fatia de vida 7 h após a infecção com o fungo são verdes, elementos fúngicos e SHG são azuis, e núcleos de células como bem como NET-estruturas são representadas em vermelho. O tempo real do experimento é mostrado no canto inferior direito. A barra de escala representa 50 mm. Clique aqui para assistir ao vídeo

Discussion

Microscopia em tempo real 2-photon in vivo ou em órgãos intactos ganhou importância profunda em estudos sobre a fisiologia das células do sistema imunológico ao longo dos últimos 10 anos. Foi com esta técnica que os eventos importantes, como a dinâmica de ativação de células T nos gânglios linfáticos primeiro tornou-se visível ^2-4. Mais recentemente, os pesquisadores também começaram a analisar funções celulares específicas, como os primeiros passos na geração de células efetoras nos tecidos linfáticos usando essa abordagem ^5.

No entanto, apesar de uma série de novos conceitos biológicos foram revelados através deste método, ainda há questões importantes e desafiadoras para as quais não existem estudos visualização intravital foram publicados até agora. Isso se aplica principalmente para o pulmão de mamíferos. O aspecto interessante deste órgão, como porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, torna-se uma das superfícies mais crucial em que processos imunológicos ocorrem no corpo dos mamíferos. Com cada respiração durante a vida inteira, as partículas não desejadas são inalados, alguns dos quais têm o potencial de induzir a infecções fatais ^6. É auto-explicativo que em um local tão sensíveis e ameaçadas de uma rede apertada de mecanismos de defesa deve estar presente exibindo todo o repertório de respostas imunes. Por outro lado, é muito importante que a luta induzida imunológico contra agentes patogénicos potenciais em tal lugar "sujo" é rigidamente controlado. Reações exageradas do sistema imunológico têm um alto risco de prejudicar o próprio corpo por maciçamente ferir o tecido do órgão com a estimulação de ações inespecíficas de células imunes ^7,8.

À luz destes pensamentos que seria extremamente interessante e útil ter a possibilidade de investigar o comportamento das células nos pulmões de mamíferos em verdade, em condições in vivo. No entanto, o fato de que um sistema desse tipo até agora não foi implementado com sucesso aponta claramente para as enormes dificuldades que têm de ser resolvidos na criação de um protocolo de trabalho. O desafio mais exigente, provavelmente, é a estabilidade foco. O pulmão como o órgão responsável pela respiração está sob constante movimento em todas as três direções do espaço para realizar inalação. Esta circunstância por si só causa problemas de imagem grave e pode ser considerado um intravital imagers "pesadelo". Já um ligeiro movimento para qualquer dimensão no espaço tem um efeito enorme deterioração da visão microscópica, que precisa ser estável com precisão micrométrica, a fim de gerar imagens significativas ^9. Dada a sua concentração inerentemente locais apertados ^10, microscopia de dois fótons é ainda mais sensível às instabilidades focal, como um deslocamento de uma certa estrutura no intervalo de apenas alguns micrômetros na direção Z é equivalente a uma completa perda de foco e, assim, uma experiência fracassada.

O protocolo apresentado neste estudo para a observação de células imunes dentro do pulmão murino ainda não é uma aplicação in vivo, mas sim uma aproximação com a situação em um pulmão funcionalmente intactas ^11. Abordagens Ex vivo de linfócitos de imagem, por exemplo, na linfa explantado nós, tem sido demonstrado que produzem resultados equivalentes a verdade em observações in vivo e, portanto, ¹² são altamente relevantes ^5. O observações in situ em cortes de pulmão, que só são possíveis com a nossa abordagem, realizada em um pulmão infectado logo após excisão. A integridade 3D durante o processo de corte é assegurada pela matriz agarose, um passo essencial para permitir um processo controlado com precisão de corte do pulmão. Embora seja necessário para resfriar o pulmão explantado por um curto período para permitir uma solidificação da matriz de agarose, é possível voltar para perto de condições fisiológicas das células após o corte e reaquecimento do tecido. Isto é claramente demonstrado pelos nossos dados, que demonstram que sob estas condições neutrófilos são muito ativas e exibem todo o seu potencial como fagócitos ágil, que são necessárias para o apuramento efectivo de uma infecção Aspergillus fumigatus. Eles patrulham o tecido pulmonar passando por barreiras epiteliais, a fim de atingir as partes internas dos alvéolos e, além disso eles ativamente assumir esporos de fungos 11. A principal conclusão deste trabalho foi o aparecimento de estruturas semelhantes neutrófilos armadilhas extracelular (NET) no órgão Aspergillus infectados. NET são uma descoberta muito recente de um mecanismo de defesa romance em neutrófilos ^13. No entanto, desde sua descrição inicial em 2004, o número de condições fisiológicas ou patológicas em modelos animais ou humanos, onde este fenômeno tem sido observado, ou está faltando foi aumentando explosivamente ^14-16. Curiosamente, apesar de tanto trabalho foi gasto nessas estruturas por tantos grupos diferentes, a maioria dos relatórios ainda estão em um nível muito descritivo e não muito ésabe sobre o mecanismo de liberação NET e seu regulamento. Com nosso protocolo pudemos pela primeira vez para mostrar fibras NET em um pulmão infectado. Além disso, conseguimos demonstrar a importância de neutrófilos recém-recrutados, bem como estruturas fúngicas molecular para a sua ocorrência ou inibição ^11. Isto mostra claramente o potencial do nosso método para investigar os passos de formação única NET em mais detalhes. Pode-se pensar, por exemplo, usar neutrófilos de camundongos knock-out adequado para observar sua capacidade de formação NET em experimentos de transferência adotiva.

Assim, embora a observação directa da imigração de neutrófilos do sangue periférico não é possível com este sistema, devido à falta de fornecimento de sangue depois de explante de órgãos, ainda acreditamos que o nosso protocolo é um método valioso e relativamente fácil de manusear que permite que a imagem de passos cedo ou mais tarde na defesa imunológica contra infecções pulmonares. Este é, portanto, um passo importante para investigar o fenômeno dentro do pulmão de respiração dos animais vivos.