Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Summary

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Abstract

Na het maagdarmkanaal, de longen is de tweede grootste oppervlak voor interactie tussen de gewervelde lichaam en het milieu. Hier moet een effectieve gasuitwisseling worden gehandhaafd, terwijl het vermijden van infectie door de vele ziekteverwekkers die worden ingeademd tijdens de normale ademhaling. Om dit te bereiken, een schitterende set van defensie strategieën te combineren humorale en cellulaire immuun mechanismen bestaat. Een van de meest effectieve maatregelen voor acute verdediging van de long is de werving van neutrofielen, die ofwel fagocyteren de ingeademde ziekteverwekkers of doden door het vrijgeven van cytotoxische stoffen. Een recente toevoeging aan het arsenaal van neutrofielen is hun explosieve afgifte van extracellulaire DNA-NET's, waardoor bacteriën of schimmels kunnen worden gevangen of geïnactiveerd zelfs na de NET loslaten van cellen gestorven zijn. We presenteren hier een methode die toelaat om direct waar te nemen neutrofielen, migreren binnen een recent geïnfecteerde longen, fagocytose schimmelpathogenen en visualiseren de uitgebreide netten die zij hebben geproduceerd door het geïnfecteerde weefsel. De methode beschrijft de bereiding van dikke levensvatbare long plakken 7 uur na intratracheale infectie van muizen met sporen van de schimmel Aspergillus fumigatus en hun onderzoek door multicolor time-lapse twee-foton microscopie. Deze aanpak maakt het mogelijk om direct te onderzoeken antifungale verdediging in de moedertaal van longweefsel en daarmee opent een nieuwe weg voor het gedetailleerd onderzoek van pulmonale immuniteit.

Protocol

1. Infectie

1. Gezwollen sporen van de schimmel Aspergillus fumigatus (stam ATCC 46645), worden gegenereerd door pre-incubatie in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlijn, Duitsland), aangevuld met 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ rust conidia zijn geresuspendeerd in 5 ml medium en geïncubeerd in een 6-well weefselkweek plaat (TPP AG; Trasadingen, Zwitserland, catalogus # 92006) voor 7 uur bij 37 ° C.
2. Na de zwelling periode worden de sporen fluorescent gelabelde door het toevoegen van 10 pi van calcofluor witte stockoplossing (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Duitsland, catalogus # F3543; [25 mg / ml] in DMSO) aan elke Aspergillus met goed in het 6-well plaat, het bereiken van een uiteindelijke calcofluor concentratie van 50 ug / ml RPMI. Na voorzichtig mengen, zijn de sporen geïncubeerd voor een extra 15 minuten bij 37 ° C.
3. In de volgende stap worden de sporen geoogst door filtratie door een 70 um cel zeef (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland). Na het wassen een keer met 10 ml PBS (centrifuge op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur) de pellet wordt geresuspendeerd in 2 ml PBS en het totale aantal gezwollen conidia bepaald door het tellen met een Neubauer kamer. Tenslotte wordt de sporensuspensie wordt gesponnen neer op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, is het supernatant voorzichtig verwijderd en de pellet geresuspendeerd tot de uiteindelijke concentratie van 1x107 sporen per 100 ul PBS.
4. Voor infectie, is 100 ul van de spore-oplossing intratracheaal toegepast in vrouwelijke muizen (C57/BL6, 8-10 weken oud, Harlan, Duitsland). Als neutrofielen zijn om ook in acht worden genomen, is het gebruik van Lys-EGFP muizen, die EGFP onder de lysozyme promotor ^een aan te bevelen. Begin met verlamming van het dier met een enkel IP-injectie van 150 ul Ketamin / Rompun-oplossing (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Duitsland (Ketamin) en Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Duitsland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml steriel NaCl [0,9%]). 5 minuten later de verdoofde muis kan worden vastgesteld met een elastische band door zijn tanden aan de helling (dwz een schuin oppervlak) aan de intubatie (aanvullende figuur 1) te vergemakkelijken. Met behulp van pincet, is de tong naar een kant getrokken en een 22G inwonende veneuze katheter (B. Braun AG, Melsungen, Duitsland, Vasofix Braunüle) kan voorzichtig worden ingebracht in de luchtpijp onder permanente verlichting met een zwanenhals lamp. De succesvolle inbrengen van de katheter wordt gecontroleerd door het observeren van regelmatige beweging van de thorax van het dier met de frequentie van de mechanische ventilator. Wanneer de succesvolle intubatie is bevestigd, is 100 ui sporesuspensie aangebracht met behulp van een 100 ul micropipet. Dit volume moet worden ingeademd door het dier, zonder bijkomende hulp in 1-2 s. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren het besmette dier gedurende 2 minuten met een klein dier ademhalingstoestel (MiniVent, Hugo Sachs, maart-Hugstetten, Duitsland) tegen een tarief van 250 ademhalingen per minuut en een inhalatie volume van 300 ul per ademhaling (aanvullende figuur 2). Na de infectie dieren terug naar hun kooi en geobserveerd om de 5 minuten tot ambulante weer. Muizen vertonen geen tekenen van pijn of ongemak tijdens de volgende incubatietijd.

2. Lung voorbereiding

1. 7 uur na besmetting met de sporen, is het dier gedood door een overdosis van isofluraan (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Duitsland) tot de bewegingen en ademhaling hebben opgehouden voor meer dan 30 seconden. Dit wordt dan gevolgd door thoracotomie als een secundaire methode om klinisch dood te verzekeren en zorgen voor visualisatie en de toegang van de luchtpijp en longen. Dan de borst wordt zorgvuldig geopend voor de longen en de bovenste luchtwegen bloot te leggen. Dan nog een 22G inwonende veneuze katheter wordt ingebracht in de luchtpijp vanaf de blootgestelde epiglottis. Door deze tubulus de longen zijn gevuld met 1 ml voorverwarmd laagsmeltende agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Duitsland) met een 1 ml spuit Omnifix (B. Braun). Zodra de longen worden gevuld van de luchtpijp wordt afgebonden met een kort stukje naaigaren en het hele dier wordt in een koelkast bij 4 ° C.
2. 15 min later, wanneer de agarose gestold is, wordt de hele long weggesneden begin van de luchtpijp. Met behulp van een paar scherpe puntige schaar, de rechter long kwab wordt vervolgens verwijderd, wordt de onderkant kort gedroogd op een vel vloeipapier en vervolgens de hele kwab is vastgelijmd aan de voorbereiding blok van een vibratome (Campden Instruments, Verenigd Koninkrijk, 752M Vibroslice ) met behulp van een druppel weefsel lijm voor de bevestiging (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Duitsland, Roti-Coll 1). Na 1 minuut het blok is geïnstalleerd in de maaikamer van de vibratome, die gevuld is met pre-gekoeld (4 ° C) PBS. De vibratome is ingesteld op een mid-range trilling (5 van de 10 Max.) En ook een matige snelheid (5 van de 10 Max.) Zodanig dat een horizontale doorsnede van delongen wordt geproduceerd. De bovenste helft van het orgel wordt dan overgebracht naar een kleine plastic petrischaaltje (5 cm diameter) waar het wordt omgekeerd en vastgezet met een zelfgemaakte platte ring (1 cm inwendige diameter), die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden, elk 1 mm van elkaar (aanvullende figuur 3). Tenslotte wordt de petrischaal is gevuld met 10 ml PBS aangevuld met 10 ul van de DNA-kleurstof Sytox Oranje [5 mM] (Invitrogen, Duitsland), wat resulteert in een uiteindelijke kleurstof concentratie van 5 uM.

3. Twee-foton laser microscopie

1. De petrischaal met daarin de longen monster wordt vervolgens geïnstalleerd onder de microscoop doel, zodat de buffer kan worden opgewarmd tot 37 ° C met een temperatuur sensor-gestuurde verwarming (aanvullende figuur 4). Twee-foton microscopie wordt dan uitgevoerd over de hele snijvlak met behulp van een Zeiss LSM 710 NLO microscoop op een rechtopstaande Axio Examiner podium uitgerust met een 20xNA1.0 water dompelen lens (Zeiss, Jena, Duitsland). Voor imaging, zijn verschillende gebieden langs de sectie gescand naar beneden tot 400 micrometer diepte met behulp van een verlichting golflengte van 800 nm opsporen van groen (530 nm) en rood (580 nm) fluorescentie, evenals de tweede harmonische generatie (SHG)-signaal en de blauw calcofluor fluorescentie (bij 400-470 nm emissie) met externe niet descanned detectoren (NDD). Naast de 2-D foto's en time lapse filmpjes (een beeld per 5-10 seconden), kunnen enkele of herhalingsduik 3-dimensionaal beeld stacks vervolgens worden weergegeven als voxel renderings of single uitgebreid onscherpe beelden of 4-D data (3D loop van de tijd) met behulp van verschillende software pakketten. Deze microscopisch kleine opstelling laat de observatie van cellulaire gedrag in een bijna intact milieu dat, zoals vormt de toegangspoort voor een verscheidenheid van de lucht pathogenen, is van enorme immunologische relevantie. Celbeweeglijkheid, fagocytose en NET productie door endogene neutrofielen na infectie met de schimmel Aspergillus fumigatus kan eenvoudig worden onderzocht onder deze in situ-omstandigheden.

4. Representatieve resultaten

Indien het wordt gedaan juist de beeldvorming zal genereren 2 - of 3-kleuren dia's of films. Hoewel de kleur is gedaan in een post processing procedure en is dus vrijelijk aanpasbaar, wij in het algemeen selecteert u een kleur-regeling die de natuurlijke kleur van de kleurstof / signaal, dat wordt gedetecteerd in de relatieve kanaal weerspiegelt. Zo zijn de Sytox kleurstoffen afgebeeld in het rood, de schimmel en de SHG-signaal wordt in blauw weergegeven en, indien aanwezig, EGFP-gelabelde cellen zijn gekleurd in het groen. In het eerste voorbeeld (fig. 1) het blauwe SHG-signaal geeft het weefsel vezels van een niet-geïnfecteerde longen en het rode Sytox signaal wordt geproduceerd door kernen van long-inwoner cellen te openen door de vibratome snijden. In het tweede voorbeeld (fig. 2) een besmette long wordt getoond, waar zowel, alveolaire structuren en schimmel massa's, verschijnen in het blauw, terwijl de kernen en de netten zijn gekleurd rood. Het derde voorbeeld (afb. 3) is uit een Lys-EGFP transgeen dier waar naast de blauwe en rode structuren van de groene neutrofielen ook kan worden gezien. De migratie van neutrofielen en hun fagocytose van individuele schimmels elementen in time lapse sequenties wordt weergegeven in de aanvullende film.

Figuur 1. Het uiterlijk van een niet-besmette long slice in 2-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice werd bereid uit een niet-geïnfecteerde C57/BL6 muis en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Hier gepresenteerde zijn de SHG signaal van de alveolaire weefsel structuur (A), de Sytox signaal van celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C). De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op: het vezelige weefsel aan de onderkant van de long slice ten opzichte van de duidelijk alveolaire organisatie binnen de ademhaling-actieve gebieden van de long hierboven.

Figuur 2. De verschijning van een long slice van een Aspergillus besmet wild type dier in twee-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een C57/BL6 muis besmet 7 uur voor het met A. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (A), de Sytox signaal van DNA-NET's alsmede celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C) . De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op, zijn de duidelijk verschillende gebieden van de schimmel massa's, longblaasjes, en NET-structuren gemarkeerd met de letters F, A en N, respectievelijk.

Figuur 3. De verschijning van een long slice van een Aspergillus geïnfecteerde Lys-EGFP dier in 3-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een Lys-EGFP muis software heeft 7 uur voor het metA. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (blauw), de Sytox signaal van celkernen en netten (rood), en evenals talrijke neutrofielen (groen).

Aanvullende figuur 1. Muis fixatie voor de intubatie. Onder Ketamin / Rompun anesthesie van het dier wordt bevestigd met een elastische band op zijn tanden om de intubatie te vergemakkelijken met een 22G inwoning veneuze katheter.

Aanvullende figuur 2. Mechanische ventilatie muis. Geïntubeerd De muis is geïnfecteerd door een IT-toepassing van 1x10 ⁷ sporen geresuspendeerd in 100 ul PBS. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren de geïnfecteerde muis met een klein dier masker.

Aanvullende figuur 3. Longkwab fixatie. Na de bereiding van de rechter long kwab het orgel is vastgesteld in een petrischaal met behulp van een laboratorium-en-klare platte ring die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden.

Aanvullende figuur 4. Twee-foton beeldvorming setup. De petrischaal met de rechter long kwab is geïnstalleerd op een mat onder de twee-foton microscoop na toevoeging van de DNA-kleurstof Sytox Orange.

Aanvullende film:. Neutrofielen migratie en fagocytose schimmel Aspergillus elementen in geïnfecteerde longen zoals gezien door tijdsverloop twee-foton microscopie van een levende long slice zeven uur na infectie met de schimmel Neutrofielen zijn groen, schimmel-elementen en SHG zijn blauw, en celkernen als evenals NET-structuren zijn weergegeven in het rood. De real-time van het experiment wordt getoond op de onderste rechts. De schaal bar geeft 50 micrometer. Klik hier om video te bekijken

Discussion

Real-time twee-foton microscopie in vivo of in intacte organen heeft opgedaan grote belang in studies het omgaan met de fysiologie van de immuuncellen in de afgelopen 10 jaar. Het was met deze techniek die belangrijke gebeurtenissen, zoals de dynamiek van het T-cel activatie in de lymfeklieren werd voor het eerst zichtbaar ^2-4. Meer recent hebben onderzoekers ook begonnen met specifieke cellulaire functies, zoals de eerste stappen in de vorming van effector cellen in lymfeweefsel het gebruik van deze aanpak ⁵ te analyseren.

Echter, hoewel een aantal nieuwe biologische concepten zijn onthuld met deze methode, er zijn nog steeds uitdagende en belangrijke vragen waarvoor geen intravitale visualisatie studies zijn tot nu toe gepubliceerd. Met name geldt dit voor het zoogdier long. Het interessante aspect van dit orgel, als instap-poort voor een verscheidenheid van de lucht pathogenen, maakt het een van de meest cruciale vlakken waarop immunologische processen plaatsvinden in het lichaam van zoogdieren. Bij elke ademhaling over de gehele levensduur, worden ongewenste deeltjes ingeademd waarvan sommige hebben het potentieel om levensbedreigende infecties veroorzaken ^6. Het spreekt voor zich dat op zo'n gevoelig en bedreigde terrein een dicht netwerk van afweermechanismen dient aanwezig te zijn tentoonstelling van de gehele repertoire van immuunreacties. Aan de andere kant is het zeer belangrijk dat de veroorzaakte immunologische strijd tegen potentiële ziekteverwekkers op een dergelijk "vuile" plaats strak wordt gecontroleerd. Overdreven reacties van het immuunsysteem zijn voorzien van een hoog risico van nadelige gevolgen voor het eigen lichaam door massaal verwonden orgaanweefsel na stimulatie van de niet-specifieke immuun-cel acties ^7,8.

In het licht van deze gedachten zou het zeer interessant en nuttig om de mogelijkheid om te onderzoeken in cel gedrag van zoogdieren longen onder ware in vivo omstandigheden. Echter, het feit dat een dergelijk systeem heeft tot dusver niet succesvol duidelijk wijst geïmplementeerd om de enorme moeilijkheden die moeten worden opgelost bij het opzetten van een werkprotocol. De meest veeleisende uitdaging is waarschijnlijk richten stabiliteit. De longen als het orgaan die verantwoordelijk is voor de ademhaling is onder constante beweging in alle drie de richtingen van de ruimte te realiseren inademing. Deze omstandigheid alleen veroorzaakt ernstige beeldvorming problemen en kan worden beschouwd als een intravitale imagers "nachtmerrie". Al een lichte beweging naar elke dimensie in de ruimte heeft een enorme verslechtering van invloed op de microscopische weergave, die moet stabiel zijn met micrometer precisie om het genereren van betekenisvolle beelden ^9. Gezien de krappe inherent lokale focus ^10, twee-foton microscopie is nog gevoeliger aan focal instabiliteiten, als een dislocatie van een bepaalde structuur in het bereik van slechts enkele micrometers in de Z-richting is gelijk aan een volledig verlies van focus en dus een mislukt experiment.

Het protocol die in deze studie voor de observatie van de immuuncellen in de longen van muizen is nog niet een in-vivo-applicatie, maar een goede benadering van de situatie in een functioneel intacte long ^11. Ex vivo benaderingen voor de beeldvorming lymfocyten, bijvoorbeeld in geëxplanteerde lymfe nodes, is aangetoond dat ze resultaten gelijkwaardig zijn aan het geval in vivo waarnemingen ¹² opbrengst en zijn dus zeer relevant ^5. De in-situ waarnemingen in de longen plakken, die alleen mogelijk zijn met onze aanpak, vinden plaats in een geïnfecteerde longen kort na excisie. De 3D-integriteit tijdens het snijproces wordt verzekerd door de agarose matrix, een essentiële stap om een ​​nauwkeurig gecontroleerde snijproces van de long mogelijk te maken. Hoewel het noodzakelijk is om de geëxplanteerd long voor een korte periode tot een verharding van de agarose matrix laat afkoelen, is het mogelijk om terug te keren naar de buurt van fysiologische omstandigheden voor cellen na het uitsnijden en opwarmen van het weefsel. Dit wordt duidelijk aangetoond door onze gegevens, waaruit blijkt dat onder deze omstandigheden neutrofielen zijn zeer actief en vertonen hun volledige potentieel als wendbaar fagocyten, die noodzakelijk zijn voor de effectieve klaring van een Aspergillus fumigatus infectie. Ze patrouilleren in het longweefsel passeren epitheliale barrières om de binnenste delen van de longblaasjes bereiken en bovendien zij actief nemen schimmelsporen 11. Een belangrijke conclusie van dit werk was de verschijning van de structuren die lijken op neutrofielen extracellulaire vallen (NET) in de Aspergillus geïnfecteerde orgaan. NET zijn een zeer recente bevinding van een nieuw afweermechanisme in neutrofielen ^13. Echter, sinds de eerste beschrijving in 2004 is het aantal van fysiologische of pathologische omstandigheden in dierlijke modellen of mensen waar dit fenomeen is waargenomen of ontbreekt is explosief stijgende ^14-16. Interessant, maar zo veel werk is besteed aan deze structuren door zo veel verschillende groepen, de meeste rapporten zijn nog steeds op een zeer beschrijvend niveau en niet veel isbekend over het mechanisme van de NET-release en de regelgeving. Met ons protocol konden we voor het eerst NET vezels in een geïnfecteerde longen te tonen. Verder konden we tonen het belang van vers aangeworven neutrofielen als moleculaire schimmel structuren voor hun optreden of remming ^11. Dit toont duidelijk het potentieel van onze methode om de afzonderlijke stappen van de NET-vorming in meer detail te onderzoeken. Men zou kunnen denken om bijvoorbeeld neutrofielen gebruik van geschikte knock-out muizen hun vermogen van de NET-vorming in adoptieve overdracht experimenten te observeren.

Dus, hoewel de directe waarneming van neutrofielen immigratie uit het perifere bloed is niet mogelijk met dit systeem te wijten aan het ontbreken van bloedvoorziening na orgaantransplantatie explantatie, we geloven nog steeds dat ons protocol is een waardevol en relatief gemakkelijk te hanteren aanpak die de beeldvorming van maakt vroeg of laat stappen in de immunologische afweer tegen longinfecties. Dit is dus een belangrijke stap op weg naar het onderzoeken van dit fenomeen binnen de ademende long van levende dieren.