Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Summary

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Abstract

Nach dem Magen-Darm-Trakt, ist die Lunge der zweitgrößten Fläche für die Interaktion zwischen den Wirbeltieren Körper und die Umwelt. Hier muss eine effektive Gasaustausch aufrechterhalten werden, während gleichzeitig die Vermeidung einer Infektion mit dem eine Vielzahl von Krankheitserregern, die während der normalen Atmung eingeatmet werden. Um dies zu erreichen, besteht eine hervorragende Reihe von Abwehrstrategien Kombination humoralen und zellulären Abwehrmechanismen. Eine der wirksamsten Maßnahmen für die akute Abwehr der Lunge ist die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten, die entweder phagozytieren die eingeatmete Erreger oder töten sie durch Freisetzung zytotoxischer Chemikalien. Eine aktuelle Ergänzung zum bestehenden Arsenal von Neutrophilen ist ihre explosive Freisetzung von extrazellulären DNA-NETs, ​​mit denen Bakterien oder Pilze verfangen oder inaktiviert werden auch nach dem Loslassen NET Zellen abgestorben sind. Wir stellen hier eine Methode, die man direkt beobachten Neutrophilen ermöglicht, die Migration in einem kürzlich infizierte Lunge, phagozytierenden pilzliche Erreger sowie Visualisierung der umfangreichen NETs, ​​dass sie in das infizierte Gewebe produziert haben. Die Methode beschreibt die Herstellung von dicken lebensfähig Lung Slices 7 Stunden nach intratrachealer Infektion von Mäusen mit Konidien des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus und deren Prüfung durch multicolor Zeitraffer-2-Photonen-Mikroskopie. Dieser Ansatz erlaubt es, direkt zu untersuchen antimykotische Verteidigung in nativen Lungengewebe und eröffnet damit einen neuen Weg für die detaillierte Untersuchung der pulmonalen Immunität.

Protocol

1. Infektion

1. Geschwollene Konidien des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus (Stamm ATCC 46645) durch Vorinkubation in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) ergänzt mit generierten 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ ruhenden Konidien sind in 5 ml Medium resuspendiert und in einer 6-well Zellkulturschale (TPP AG; Trasadingen, Schweiz, Katalog Nr. 92006) für 7h bei 37 ° C.
2. Jedem Aspergillus enthält auch in die 6-well; Nach der Schwellung Zeitraum werden die Sporen Fluoreszenz durch Zugabe von 10 ul der Calcofluor weiß Stammlösung ([25 mg / ml] in DMSO Sigma Aldrich, Deisenhofen, Deutschland, Katalog # F3543) gekennzeichnet Platte, auf die endgültige Calcofluor Konzentration von 50 ug / ml RPMI. Nach sanftem Mischen werden die Sporen für weitere 15 min bei 37 ° C inkubiert
3. Im nächsten Schritt werden die Sporen durch Filtration durch ein 70 um Zellsieb (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) geerntet. Nach einmaligem Waschen mit 10 ml PBS (Zentrifuge bei 900xg für 5 min bei Raumtemperatur) wird das Pellet in 2 ml PBS und die Gesamtzahl der geschwollenen Konidien durch Zählen mit einer Neubauer Kammer bestimmt resuspendiert. Schließlich wird die Sporensuspension stillgelegt ist 900xg für 5 min bei Raumtemperatur gesponnen wird der Überstand vorsichtig entfernt und das Pellet resuspendiert, um die endgültige Konzentration von 1x107 Sporen pro 100 ul PBS.
4. Zur Infektion wird 100 pl spore Lösung intratracheal in weiblichen Mäusen (C57/BL6, 8-10 Wochen alt, Harlan, Deutschland) eingesetzt. Wenn Neutrophile als auch beobachtet werden, ist die Verwendung von Lys-EGFP Mäuse, Durchführung EGFP unter der Lysozym-Promotor ¹ empfohlen. Beginnen Sie mit der Betäubung des Tieres mit einem einzigen ip-Injektion von 150 ul Ketamin / Rompun Lösung (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland (Ketamin) und Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml sterile NaCl [0,9%]). 5 Minuten später den narkotisierten Maus kann mit einem Gummiband durch die Zähne an der Rampe (dh eine geneigte Fläche), um die Intubation (ergänzende Abbildung 1) zu erleichtern fixiert werden. Mit einer Pinzette wird die Zunge auf der einen Seite und eine 22G innewohnende Katheter (B. Braun AG, Melsungen, Deutschland, Vasofix Braunüle) kann leicht in die Luftröhre werden unter ständiger Beleuchtung mit einem Schwanenhals-Lampe eingesetzt gezogen. Die erfolgreiche Einführung des Katheters wird durch die Beobachtung regelmäßiger Bewegung des Tieres Thorax mit der Frequenz der mechanischen Ventilator überprüft. Wenn die erfolgreiche Intubation bestätigt wurde, ist 100 ul Sporensuspension unter Verwendung einer 100 ul Mikropipette. Dieses Volumen sollte durch das Tier ohne zusätzliche Hilfe in 1-2 s. eingeatmet werden Eine verbesserte Verteilung der Pilz-Partikel in der Lunge wird durch mechanisch Belüftung des infizierten Tieres für 2 Minuten mit einem kleinen Tier Atemschutzmaske (Minivent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Deutschland) mit einer Rate von 250 Atemzüge pro Minute und einer Inhalation von 300 erreicht ul pro Atemzug (ergänzende Abbildung 2). Nach der Infektion Tiere ihren Käfig zurück und beobachtet alle 5 Minuten, bis der ambulanten wieder. Mäuse zeigen keine Anzeichen von Schmerzen oder Leiden während der folgenden Inkubationszeit.

2. Lung Vorbereitung

1. 7 h nach der Infektion mit den Sporen wird das Tier durch eine Überdosis eingeschläfert Isofluran (Baxter GmbH, Unterschleißheim, Deutschland), bis Bewegungen und Atmung sind seit mehr als 30 Sekunden eingestellt. Diese wird dann durch Thorakotomie als sekundäre Methode zur klinischen Tod versichern und damit für die Visualisierung und den Zugang der Luftröhre und der Lunge gefolgt. Dann wird die Brust vorsichtig geöffnet, um der Lunge und der oberen Atemwege aussetzen. Dann noch 22G innewohnende Katheter wird in die Luftröhre ab der exponierten Epiglottis eingefügt. Durch diese Röhrchen die Lungen werden mit 1 ml vorgewärmten niedrig schmelzender Agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung einer 1 ml Spritze Omnifix (B. Braun) gefüllt. Sobald die Lungen gefüllt sind die Luftröhre wird mit einem kurzen Stück Nähgarn gebunden und das ganze Tier wird in einem Kühlschrank bei 4 ° C stellen
2. 15 min später, als die Agarose erstarrt ist, wird die ganze Lunge herausgeschnitten Anfang der Luftröhre. Mit ein paar spitzen Schere, das Recht Lungenlappen später entfernt wird, ist die Bodenfläche kurz auf ein Blatt Seidenpapier getrocknet und dann die ganze Lappen ist mit der Vorbereitung Block eines Vibratom (Campden Instruments, UK, 752m Vibroslice geklebt ) mit einem Tropfen Gewebekleber zur Fixierung (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland, Roti-Coll 1). Nach 1 min wird der Block in den Mahlraum der Vibratom, die mit vorgekühlten (4 ° C) PBS gefüllt ist installiert. Die Vibratom ist eine Mid-Range-Vibration (5 von 10 max.) Und auch mäßiger Geschwindigkeit (5 von 10 max.), So dass ein horizontaler Querschnitt der eingestelltenLunge produziert wird. Die obere Hälfte der Orgel wird dann in ein kleines Kunststoff-Petrischale (5 cm Durchmesser), wo es umgekehrt und ist mit einem self-made Unterlegscheibe (1 cm Innendurchmesser), die durch eine Reihe von parallel Nylonfäden bedeckt ist dort fixiert, jeweils 1 mm auseinander (ergänzende Abbildung 3). Schließlich wird die Petrischale mit 10 ml PBS mit 10 ul der DNA-Farbstoff Sytox Orange [5 mm] (Invitrogen, Deutschland), die sich in einer abschließenden Farbstoff-Konzentration von 5 uM ergänzt gefüllt.

3. 2-Photonen-Laser-Mikroskopie

1. Die Petrischale mit der Lunge Probe wird dann unter dem Mikroskop-Objektiv eingebaut, so dass der Puffer auf 37 ° C kann durch einen Temperatursensor-gesteuerte Heizung (ergänzende Abbildung 4) erwärmt werden. 2-Photonen-Mikroskopie wird dann über die gesamte Schnittfläche mit einem Zeiss-Mikroskop LSM 710 NLO auf eine aufrechte Axio Examiner Bühne mit einer 20xNA1.0 Wasser getaucht Objektiv (Zeiss, Jena, Deutschland) ausgestattet ist. Für die Bildgebung werden verschiedene Bereiche entlang der Schnittlinie bis 400 mu m Tiefe abgetastet mit einer Ausleuchtung Wellenlänge von 800 nm erkennen Grün (530 nm) und rot (580 nm) Fluoreszenz, sowie die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Signal und die blau Calcofluor Fluoreszenz (bei 400-470 nm Emission) mit externem nicht descanned Detektoren (NDD). Neben 2-D-Bilder und Zeitraffer-Filme (1 Bild alle 5-10 Sekunden), können einzelne oder wiederholende 3-dimensionales Bild Stapel anschließend als Voxel Renderings oder einzelnen erweiterten Fokus Bilder oder 4-D-Daten (3D über die Zeit) mit gerendert werden verschiedenen Software-Paketen. Diese mikroskopischen Aufbau ermöglicht die Beobachtung von zellulären Verhaltens in einer fast intakten Umwelt, die, wie es den Eintrag Port stellt für eine Vielzahl von Luft-Erreger, ist von enormer immunologische Relevanz. Zellbewegung, Phagozytose und NET Produktion von körpereigenen Neutrophilen nach der Infektion mit dem Schimmelpilz Aspergillus fumigatus kann leicht unter diesen werden in situ-Bedingungen untersucht.

4. Repräsentative Ergebnisse

Wenn man es richtig macht der Bildgebung erzeugt 2 - oder 3-Farb-Dias oder Filme. Obwohl Färbung in einem Post-Processing Verfahren durchgeführt wird und ist somit frei anpassbar, wir in der Regel wählen Sie ein Farbschema, das die natürliche Farbe des Farbstoffs / Signal, das in der relativen Kanal erkannt wird reflektiert. So sind die Sytox Farbstoffe in rot, der Pilz sowie die SHG-Signal wird in blau dargestellt dargestellt und, falls vorhanden, EGFP-markierten Zellen sind grün angefärbt. Im ersten Beispiel (Abb. 1) den blauen SHG-Signal zeigt das Gewebe Fasern eines nicht-infizierten Lunge und die rote Sytox Signal wird von Kernen der Lunge ansässigen Zellen produziert aufgeschnitten durch die Vibratom. Im zweiten Beispiel (Abb. 2) einer infizierten Lunge gezeigt, wo beide, alveoläre Strukturen sowie Pilz-Massen, in blau erscheinen, während Kerne und NETs gefärbt sind rot. Das dritte Beispiel (Abb. 3) wird aus einer Lys-EGFP transgenen Tieres, wo zusätzlich zu den blauen und roten Strukturen der grünen Neutrophilen auch gesehen werden kann. Die Migration von Neutrophilen und deren Phagozytose von einzelnen Pilzelemente im Zeitraffer-Sequenzen ist in den ergänzenden Film gezeigt.

Abbildung 1. Das Erscheinungsbild einer nicht-infizierten Lunge Scheibe in 2-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Scheibe wurde aus einer nicht-infizierten C57/BL6 Maus vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Präsentiert werden hier die SHG-Signal des alveolaren Struktur (A), schneiden Sie die Sytox Signal von Zellkernen während der Vorbereitung der Lunge Scheibe (B), und eine Überlagerung der beiden Kanäle (C) zu öffnen. Die boxed-Bereich in (C) ist ersichtlich, vergrößert in (D). Bitte beachten Sie die faserige Gewebe am unteren Rand der Lunge Scheibe im Vergleich zu den deutlich alveoläre Organisation innerhalb der Atem-aktiven Bereiche der Lunge vor.

Abbildung 2. Das Erscheinungsbild einer Lungen-Scheibe einer Aspergillus-Infektion Wildtyp Tier in 2-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Slice aus einer C57/BL6 Maus infiziert 7 h, bevor mit A. fumigatus wurde vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Dargestellt ist die kombinierte Pilz Struktur und SHG des alveolaren (A), die Sytox Signal DNA NETs gehören sowie die Zellkerne schneiden bei der Vorbereitung der Lunge Scheibe (B) zu öffnen, und eine Überlagerung der beiden Kanäle (C) . Die boxed-Bereich in (C) ist ersichtlich, vergrößert in (D). Bitte beachten Sie, sind die deutlich unterschiedlichen Bereichen der Pilz-Massen, Alveolen, und NET-Strukturen mit den Buchstaben F, A und N, jeweils markiert.

Abbildung 3. Das Erscheinungsbild einer Lungen-Scheibe einer Aspergillus-Infektion Lys-EGFP Tier in 3-farbig 2-Photonen-Mikroskopie. Ein Lunge Scheibe eines Lys-EGFP Maus infiziert 7 h, bevor mitA. fumigatus wurde vorbereitet und abgebildet wie im Protokoll beschrieben. Dargestellt ist die kombinierte Pilz Struktur und SHG des alveolaren (blau), die Sytox Signal von Zellkernen und NETs (rot), sowie auch zahlreiche Neutrophile (grün).

Supplemental Abbildung 1. Maus Fixierung zur Intubation. Under Ketamin / Rompun Narkose wird das Tier mit einem Gummiband an den Zähnen befestigt, um die Intubation mit einer 22G innewohnende Katheter zu erleichtern.

Supplemental Abbildung 2 dargestellt. Mechanische Maus Belüftung. Die intubierten Maus wird durch eine IT-Anwendung von 1x10 ⁷ Sporen in 100 ul PBS resuspendiert infiziert. Eine verbesserte Verteilung der Pilz-Partikel in der Lunge wird durch mechanisch Belüftung der infizierten Maus mit einem kleinen Tier Beatmungsgerät erreicht.

Supplemental Abbildung 3 dargestellt. Lungenlappen Fixierung. Nach der Vorbereitung des rechten Lungenlappen des Organs wird in einer Petrischale mit Hilfe eines im Labor hergestellte Unterlegscheibe, die durch eine Reihe von parallel Nylonfäden bedeckt ist fixiert.

Supplemental Abbildung 4. 2-Photonen-Imaging-Setup. Die Petrischale mit dem rechten Lungenflügel ist auf eine Heizmatte unter der 2-Photonen-Mikroskop nach Zugabe der DNA-Farbstoff Sytox orange installiert.

Supplemental Film:. Neutrophile Migration und phagozytierenden Pilzelemente in Aspergillus infizierte Lunge durch Zeitablauf 2-Photonen-Mikroskopie eines lebenden Lunge Scheibe 7 h nach der Infektion mit dem Pilz gesehen Neutrophile sind grün, Pilz-Elemente und SHG sind blau, und Zellkerne als sowie NET-Strukturen sind in rot dargestellt. Die Echtzeit des Versuchs ist auf der unteren rechten Seite angezeigt. Der Maßstab zeigt 50 um. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen

Discussion

Real-time 2-Photonen-Mikroskopie in vivo-oder in intakten Organen hat eine tiefgründige Bedeutung in Studien, die sich mit der Physiologie der Immunzellen in den vergangenen 10 Jahren gewonnen. Es war mit dieser Technik, die wichtige Ereignisse wie die Dynamik von T-Zell-Aktivierung in den Lymphknoten wurde erst sichtbar ^2-4. In jüngster Zeit haben Forscher damit begonnen, spezifische zelluläre Funktionen wie die ersten Schritte in die Generierung von Effektor-Zellen in den lymphatischen Geweben mit diesem Ansatz ⁵ zu analysieren.

Doch obwohl eine Reihe von neuen biologischen Konzepten aufgedeckt wurden mit dieser Methode gibt es immer noch eine Herausforderung und wichtige Fragen, für die keine intravitalen Visualisierung Studien veröffentlicht wurden bislang. Insbesondere gilt dies für die Säuger Lunge. Der interessanteste Aspekt dieses Organs, als Eintrittspforte für eine Vielzahl von Luft-Erreger, macht ihn zu einem der wichtigsten Flächen, an denen immunologische Prozesse finden in den Körper von Säugetieren. Mit jedem Atemzug über die gesamte Lebensdauer, sind unerwünschte Partikel, von denen einige das Potenzial, lebensbedrohliche Infektionen hervorrufen ⁶ eingeatmet. Es ist selbstverständlich, dass bei einem so sensiblen und gefährdeten Ort ein dichtes Netz von Abwehrmechanismen vorhanden sein ausstellenden das gesamte Repertoire von Immunantworten benötigt. Auf der anderen Seite ist es sehr wichtig, dass die induzierte immunologische Kampf gegen potenzielle Krankheitserreger in einem solchen "schmutzigen" Ort eng kontrolliert wird. Übertriebene Reaktionen des Immunsystems tragen ein hohes Risiko der Schädigung des eigenen Körpers durch massiv verletzt Organgewebe nach Stimulation von unspezifischen Immunzellen Aktionen ^7,8.

Im Lichte dieser Überlegungen wäre es sehr interessant und hilfreich, um die Möglichkeit, das Verhalten der Zelle in Säugetier-Lunge untersucht werden, unter echten Bedingungen in vivo haben. Die Tatsache jedoch, dass ein solches System bisher nicht erfolgreich weist eindeutig auf die enormen Schwierigkeiten, die in die Einrichtung einer Arbeitsgruppe Protokoll gelöst werden müssen umgesetzt werden. Die größte Herausforderung ist wahrscheinlich Fokus Stabilität. Die Lunge als Organ für die Atmung ist unter ständiger Bewegung in allen drei Richtungen des Raumes, um ein Einatmen zu realisieren. Allein dieser Umstand führt zu schweren Imaging Probleme und kann als eine intravitale Imager "Albtraum" werden. Schon eine kleine Bewegung, jedes beliebige Maß im Raum hat eine massive Verschlechterung der Wirkung auf die mikroskopische Ansicht, die mit Mikrometer-Präzision stabil, um zu erzeugen aussagekräftige Bilder zeigen ⁹ benötigt. Aufgrund ihrer von Natur aus eng lokalen Fokus ^10, 2-Photonen-Mikroskopie ist sogar noch empfindlicher auf Schwerpunkte Instabilitäten, wie eine Versetzung von einer bestimmten Struktur im Bereich von wenigen Mikrometern in der Z-Richtung entspricht einem vollständigen Verlust des Fokus und damit ein gescheitertes Experiment.

Das Protokoll in dieser Studie für die Beobachtung von Immunzellen im murinen Lunge präsentiert ist noch nicht in vivo-Anwendung, sondern eine Annäherung an die Situation in einem funktionell intakten Lunge ^11. Ex-vivo-Ansätze für die Bildgebung Lymphozyten, z. B. in explantierten Lymphknoten Knoten haben gezeigt, dass gleichwertige Ergebnisse wie mit echten in vivo-Beobachtungen ^{12 RENDITEOPT} und sind daher von großer Bedeutung ^5. Die in situ Beobachtungen in Lung Slices, die nur mit unserem Ansatz möglich, statt in einer infizierten Lunge kurz nach Exzision. Die 3D-Integrität während des Schneidens wird durch die Agarose-Matrix, ein wesentlicher Schritt, um eine genau kontrollierte Schneiden der Lunge ermöglichen gewährleistet. Obwohl es notwendig, die explantierten Lunge für einen kurzen Zeitraum zu einer Verfestigung der Agarose-Matrix erlauben cool ist, ist es möglich, in der Nähe von physiologischen Bedingungen für die Zellen nach dem Schneiden und Erwärmen des Gewebes zurück. Dies ist eindeutig durch unsere Daten, was bedeutet, dass unter diesen Bedingungen Neutrophilen sehr aktiv sind und zeigen ihr volles Potenzial als agile Fresszellen, die für die effektive Abfertigung eines Aspergillus fumigatus Infektion zu demonstrieren. Sie patrouillieren im Lungengewebe durch epitheliale Barrieren, um die inneren Teile der Alveolen zu erreichen und sie zudem aktiv aufgreifen Pilzsporen 11. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit war die Darstellung von Strukturen ähnlich Neutrophile extrazelluläre Traps (NETs) in der Aspergillus befallenen Organ. NETs sind eine sehr junge Feststellung eines neuen Abwehrmechanismus in Neutrophilen ^13. Doch seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2004 hat die Zahl der physiologische oder pathologische Zustände in Tiermodellen oder Menschen, wo dieses Phänomen beobachtet worden ist oder fehlt, wurde explosionsartig steigenden ^14-16. Interessanterweise, obwohl so viel Arbeit an diesen Strukturen wurde von so vielen verschiedenen Gruppen verbrachten, sind die meisten Berichte weiterhin auf einem sehr deskriptiven Ebene und nicht viel istbekannt über den Mechanismus der NET Version und ihrer Regulierung. Mit unserem Protokoll konnten wir zum ersten Mal auf NET-Fasern in einer infizierten Lunge zeigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, wie wichtig frisch rekrutierten neutrophilen Granulozyten sowie molekulare Pilzstrukturen für ihr Auftreten oder die Hemmung ^11. Dies zeigt deutlich das Potenzial unserer Methode, um die einzelnen Schritte der NET-Bildung näher zu untersuchen. Man könnte denken, zum Beispiel an Neutrophile aus geeigneten knock-out Mäuse nutzen, um ihre Fähigkeit NET Bildung in Adoptiv-Transfer-Experimenten zu beobachten.

Obwohl also die direkte Beobachtung der neutrophilen Zuwanderung aus dem peripheren Blut ist nicht mit diesem System aufgrund der mangelnden Blutversorgung nach Organentnahme möglich ist, wir immer noch glauben, dass unser Protokoll eine wertvolle und relativ leicht zu handhaben Ansatz, der die Darstellung von ermöglicht, ist früh oder zu spät Schritte in der Immunabwehr gegen Infektionen der Lunge. Dies ist daher ein wichtiger Schritt zur Erforschung dieses Phänomens in der Atmung Lunge von lebenden Tieren.