Direkt observation av fagocytos och NET-bildande genom Neutrofiler i infekterade lungor med hjälp av två-photon Mikroskopi

Summary

Vi visar, hur man använder 2-foton mikroskopi för observation av dynamiken i neutrofila granulocyter i infekterade lungor medan de phagocytose patogener eller producera neutrofil extracellulärt fällor (NET).

Abstract

Efter mag-tarmkanalen, är lungan den näst största ytan för samverkan mellan ryggradsdjur kroppen och miljön. Här måste en effektiv gasväxling upprätthållas, samtidigt som man undviker infektion av olika patogener som andas in under normal andning. För att uppnå detta finns en fantastisk uppsättning av försvarsstrategier kombinera humorala och cellulära immunförsvaret mekanismer. En av de mest effektiva åtgärderna för akut försvar av lungan är rekryteringen av neutrofiler, som antingen phagocytose den inandade patogener eller döda dem genom att släppa cytotoxiska kemikalier. Ett nytt tillägg till den arsenal av neutrofiler är deras explosiva utsläpp av extracellulärt DNA-NET med vilka bakterier eller svamp kan smitta eller inaktiverat även efter NET släppa cellerna har dött. Vi presenterar här en metod som tillåter en att direkt observera neutrofiler, migrering inom en nyligen smittad lunga, phagocytosing svamppatogener samt visualisera den omfattande nät som de har producerat under hela den infekterade vävnaden. Metoden beskriver beredningen av tjocka livskraftiga lunga skivor 7 timmar efter intratrakeal infektion av möss med conidia av formen Aspergillus fumigatus och deras granskning av multicolor tidsförlopp 2-foton mikroskopi. Detta tillvägagångssätt gör att man direkt undersöka svampdödande försvar i modersmål lungvävnad och därmed öppnar en ny väg för detaljerad utredning av pulmonell immunitet.

Protocol

1. Infektion

1. Svullna conidia av mögel Aspergillus fumigatus (stam ATCC 46.645) genereras av förhandsfinansieringen inkubation i RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) kompletterat med 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ vila conidia är suspenderade i 5 ml medium och inkuberas i en 6-och vävnadsodling plattan (TPP AG, Trasadingen, Schweiz, katalog # 92.006) för 7h vid 37 ° C.
2. Efter svullnad perioden, är de sporer fluorescerande genom att tillsätta 10 ìl calcofluor vita stamlösning (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Tyskland, katalog # F3543, [25 mg / ml] i DMSO) till varje Aspergillus innehåller bra i 6-väl tallrik, att nå en slutlig calcofluor koncentration av 50 mikrogram / ml RPMI. Efter varsam blandning, är de sporer inkuberas i ytterligare 15 minuter vid 37 ° C.
3. I nästa steg, är de sporer skördas genom filtrering genom en 70 ìm cell sil (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Efter tvättning gång med 10 ml PBS (centrifugera vid 900xg i 5 min vid rumstemperatur) pelleten är suspenderade i 2 ml PBS och det totala antalet svullna conidia bestäms genom att räkna med ett Neubauer kammare. Slutligen sporsuspensionen spinns ner på 900xg i 5 min vid rumstemperatur är supernatanten försiktigt bort och pelleten resuspenderas att den slutliga koncentrationen 1x107 sporer per 100 l PBS.
4. För infektion är 100 ìl av spor-lösning tillämpas intratracheally i honmöss (C57/BL6, 8-10 veckor gamla, Harlan, Tyskland). Om neutrofiler skall iakttas också, är användningen av Lys-EGFP möss, bärande EGFP under lysozym promotor ¹ rekommenderas. Börja med att anesthetizing djuret med en enda ip injektion av 150 l Ketamin / Rompun lösning (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Tyskland (Ketamin) och Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Tyskland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml steril NaCl [0,9%]). 5 minuter senare sövd mus kan fästas med ett gummiband med sina tänder till rampen (dvs en sluttande yta) för att underlätta intubation (kompletterande figur 1). Använd pincett, är tungan dras åt sidan och en 22g kvarliggande venkateter (B. Braun AG, Melsungen, Tyskland, Vasofix Braunüle) kan försiktigt in i luftstrupen under ständig belysning med en gås hals lampa. Det framgångsrika införandet av katetern verifieras genom att observera regelbunden rörelse av djurets bröstkorgen med frekvensen av den mekaniska fläkten. När den framgångsrika intubation har bekräftats, är 100 l sporsuspension appliceras med en 100 l mikropipett. Denna volym bör inandas av djuret utan ytterligare hjälp i 1-2 s. En förbättrad distribution av svamp partiklarna inuti lungan uppnås genom att mekaniskt ventilera det smittade djuret i 2 minuter med ett litet djur andningsskydd (Minivent, Hugo Sachs, mars-Hugstetten, Tyskland) med hastighet av 250 andetag per minut och en inandning volym av 300 l per andetag (kompletterande figur 2). Efter infektionen djuren tillbaka till sin bur och observerade var 5 minuter tills ambulatorisk igen. Möss inte visar några tecken på smärta eller obehag under den följande inkubationstiden.

2. Lung förberedelse

1. 7 timmar efter infektion med sporer, är djuret avlivas genom en överdos av isofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Tyskland) tills rörelser och andning har upphört för mer än 30 sekunder. Detta följs sedan av torakotomi som en sekundär metod att säkerställa klinisk död och möjliggöra visualisering och åtkomst av luftstrupe och lungor. Då bröstet är noga öppnas för att avslöja lungan och de övre luftvägarna. Sedan en annan 22g kvarliggande venkateter sätts in i luftstrupen med början från den exponerade struplocket. Genom denna tubuli lungorna är fyllda med 1 ml förvärmda låg smältpunkt Agar (2% w / v, Promega, Mannheim, Tyskland) med en 1 ml Omnifix spruta (B. Braun). Så snart lungorna fylls luftstrupe fästs med en kort bit sytråd och hela djuret sätts i ett kylskåp vid 4 ° C.
2. 15 min senare, när agaros har stelnat är hela lungan exciderad början från luftstrupen. Hjälp av ett par vassa saxar, höger lunga lob därefter tas bort, är bottenytan kort torkas på ett ark silkespapper och sedan hela loben limmas till utarbetandet block av en vibratome (Campden Instrument, Storbritannien, 752M Vibroslice ) med en droppe av vävnad lim för fixering (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Tyskland, Roti-Coll 1). Efter 1 min blocket är installerad i den skärande kammare vibratome, som är fylld med redan kyld (4 ° C) PBS. Den vibratome är inställd på en mid-range vibrationer (5 av 10 max.) Och även måttlig fart (5 av 10 max.) Så att ett horisontellt tvärsnittlunga produceras. Den övre delen av orgeln överförs sedan till en liten plast petriskål (5 cm i diameter) där det är upp och ned och fixeras med en self-made platt bricka (1 cm innerdiameter) som omfattas av ett antal parallella nylon trådar, varje 1 mm från varandra (kompletterande figur 3). Slutligen petriskål fylld med 10 ml PBS kompletteras med 10 ìl av DNA färgämnet Sytox Orange [5 mm] (Invitrogen, Tyskland) vilket ger en slutlig färg koncentration på 5 mikroM.

3. 2-photon laser mikroskopi

1. Petriskålen innehåller lungan provet sedan installeras under mikroskop mål, så att bufferten kan värmas till 37 ° C med en temperatur sensorstyrda värmare (kompletterande bild 4). 2-foton mikroskopi sker sedan över hela skär ytan med ett Zeiss LSM 710 NLO mikroskop på en upprätt Axio Examiner scenen utrustad med en 20xNA1.0 vatten doppa objektiv (Zeiss Jena, Tyskland). För bildbehandling, olika områden längs avsnittet skannade ner till 400 ìm djup med en belysning våglängd på 800 nm upptäcka gröna (530 nm) och rött (580 nm) fluorescens, liksom andra harmonic generation (SHG)-signalen och blå calcofluor fluorescens (vid 400-470 nm utsläpp) med externa descanned icke detektorer (NDD). Förutom 2-D bilder och tid filmer förfaller (1 bild varje 5-10 sekunder) kan enstaka eller upprepade 3-dimensionell bild stackar därefter återges som Voxel renderingar eller enstaka förlängd bilder fokusera eller 4-D-data (3D över tid) med hjälp av olika mjukvarupaket. Denna mikroskopiska installation tillåter observation av cellulära beteende i ett nästan intakt miljö som, eftersom det utgör posten port för en mängd olika luftburna patogener, är av stor immunologisk relevans. Cell motilitet, fagocytos och nettoproduktion av endogena neutrofiler efter infektion med mögel Aspergillus fumigatus enkelt kan undersökas under dessa in situ-förhållanden.

4. Representativa resultat

Om det görs korrekt avbildning kommer att generera 2 - eller 3-färg diabilder eller filmer. Även färgning sker i ett inlägg förädling och är därmed fritt anpassningsbar, väljer vi i allmänhet en färg system som återspeglar den naturliga färgen på färgen / signal, som upptäcks i den relativa kanal. Således är de Sytox färgämnen som avbildas i rött, svampen samt SHG-signalen visas i blått och, om närvarande EGFP-märkta celler färgade i grönt. I det första exemplet (Fig. 1) den blå SHG signalen skildrar vävnad fibrer med en icke-infekterade lungor och den röda Sytox signalen är producerad av kärnor av lung-inhemska celler uppskuren av vibratome. I det andra exemplet (Figur 2) en infekterad lunga visas, där båda, alveolära strukturer samt svamp massorna, visas i blått, medan kärnor och nät färgas röda. Det tredje exemplet (bild 3) är från en Lys-EGFP transgena djur där förutom de blå och röda strukturer gröna neutrofiler kan också ses. Migration av neutrofiler och deras fagocytos av enskilda svamp element i sekvenser tid förflutit visas i kompletterande filmen.

Figur 1. Utseendet på en icke-infekterade lungor skiva i 2-färg 2-foton mikroskopi. Var en lunga skiva beredd från en icke-infekterade C57/BL6 mus och avbildas som beskrivs i protokollet. Presenteras här är de SHG signal alveolära vävnad struktur (A), klipp Sytox signalen från cellkärnorna öppna under utarbetandet av lungan slice (B) och en överlagring av de två kanalerna (C). Den inramade området i (C) ses förstoras i (D). Observera den fibrösa vävnaden längst ner i lungan skiva jämfört med tydligt alveolära organisationen inom andning-aktiva områden i lungan ovan.

Figur 2. Utseendet på en lunga bit av en Aspergillus-smittade vilda typ djur i 2-färg 2-foton mikroskopi. En lunga skiva från en C57/BL6 mus infekterad 7 h före med A. fumigatus var förberedd och avbildas som beskrivs i protokollet. Som visas är den kombinerade svamp struktur och SHG av alveolära vävnad (A), Sytox signalen av DNA NET samt cellkärnor skära upp under utarbetandet av lungan slice (B) och en överlagring av de två kanalerna (C) . Den inramade området i (C) ses förstoras i (D). Observera är klart åtskilda områden svamp massor, alveolerna, och NET-strukturer märkt med bokstäverna F, A och N, respektive.

Figur 3. Utseendet på en lunga bit av en Aspergillus-smittad Lys-EGFP djur i 3-färg 2-foton mikroskopi. En lunga bit av en Lys-EGFP mus infekterad 7 timmar innan medA. fumigatus var förberedd och avbildas som beskrivs i protokollet. Som visas är den kombinerade svamp struktur och SHG av alveolära vävnad (blå), de Sytox signal cellkärnor och nät (rött), samt samt ett stort antal neutrofiler (grön).

Kompletterande figur 1. Mus fixering för intubation. Under Ketamin / Rompun anestesi djuret fixeras med ett elastiskt band på sina tänder för att underlätta intubering med en 22g kvarliggande venkateter.

Kompletterande figur 2. Mekanisk mus ventilation. Det intuberade musen är infekterad av en IT-tillämpning av 1x10 ⁷ sporer suspenderade i 100 l PBS. En förbättrad distribution av svamp partiklarna inuti lungan uppnås genom att mekaniskt ventilera den infekterade musen med ett litet djur respirator.

Kompletterande figur 3. Lung lob fixering. Efter beredning av höger lunga lob orgeln är fast i en petriskål med hjälp av ett laboratorium-made platt bricka som omfattas av ett antal parallella nylon trådar.

Kompletterande figur 4. 2-foton imaging setup. Petriskålen innehåller höger lunga lob är installerat på en värmematta under 2-fotonen mikroskop efter tillsats av DNA färgämnet Sytox Orange.

Kompletterande film:. Neutrofiler migrering och phagocytosing svamp element i Aspergillus infekterade lungor sedda av tid förfaller 2-foton mikroskopi av en levande lunga bit 7 timmar efter infektion med svampen Neutrofiler är grönt, svamp-element och SHG är blå, och cellkärnorna som samt NET-strukturer skildras i rött. Den verkliga tiden för experimentet visas i det nedre högra. Skalningsfält skildrar 50 ìm. Klicka här för att se på video

Discussion

Real-time 2-foton mikroskopi in vivo eller in intakta organ har fått djupgående betydelse i studier som handlar om fysiologi av immunceller under de senaste 10 åren. Det var med denna teknik att viktiga händelser som dynamiken i T-cells aktivering inom lymfkörtlarna först blev synliga ^2-4. På senare tid har forskarna också börjat analysera specifika cellulära funktioner som de första stegen i skapandet av effektor celler i lymfatiska vävnader med hjälp av denna metod ^5.

Men trots ett antal nya biologiska koncept har visat med den här metoden finns det fortfarande utmanande och viktiga frågor för vilka det inte intravital visualisering undersökningar har publicerats hittills. Framför allt gäller detta de däggdjur lungan. Den intressanta aspekten av detta organ, som inresa port för en mängd olika luftburna patogener, gör den till en av de mest avgörande ytor där immunologiska processer äger rum i däggdjurens kropp. Med varje andetag hela livslängd, är oönskade partiklar andas in en del som har potential att inducera livshotande infektioner ^6. Det är självklart att vid en sådan känslig och hotade platsen ett tätt nätverk av försvarsmekanismer behöver vara närvarande uppvisar hela repertoaren av immunsvaret. Å andra sidan är det mycket viktigt att immunologiska kampen mot potentiella patogener på en sådan "smutsig" plats är hårt kontrollerad. Överdrivna reaktioner av immunförsvaret bära en hög risk för att skada den egna kroppen genom massivt skadades organvävnad vid stimulering av ospecifika immunceller åtgärder ^7,8.

Mot bakgrund av dessa tankar skulle det vara mycket intressant och bra att ha möjlighet att undersöka cellens beteende hos däggdjur lungorna i sann in vivo-förhållanden. Det faktum att ett sådant system har hittills inte lyckats genomförts tydligt pekar på de enorma svårigheter som måste lösas i inrättandet av en arbetsgrupp protokoll. Den mest krävande utmaning är nog fokus stabilitet. Lungan som organ som ansvarar för andningen är under ständig rörelse i alla tre riktningar i rymden för att förverkliga inandning. Denna omständighet ensam orsakar svår avbildning problem och kan betraktas som en intravital värmekameror "mardröm". Redan en liten rörelse till en dimension i rymden har en massiv negativ inverkan på mikroskopiska uppfattning, som måste vara stabil med mikrometer precision för att generera meningsfulla bilder ^9. Med tanke på dess inneboende snäva lokalt fokus ^10, 2-foton mikroskopi är ännu mer känslig för fokal instabiliteter, som en förskjutning av en viss struktur i storleksordningen några mikrometer i Z-riktning motsvarar en total förlust av fokus och därmed ett misslyckat experiment.

Protokollet som presenteras i denna studie för observation av immunceller i murina lungorna är fortfarande inte en in vivo ansökan, utan snarare en noggrann uppskattning av situationen i ett funktionellt intakta lunga ^11. Ex vivo-metoder för avbildning lymfocyter, t.ex. i explanterade lymfan knutpunkter, har visat sig ge resultat som motsvarar verkliga in vivo-observationer ¹² och därmed är högst relevanta ^5. In situ observationer i lungorna skivor, som är bara möjligt med vår strategi, att äga rum i en smittad lunga strax efter excision. 3D-integritet under skärprocessen säkerställs genom agaros matris, ett viktigt steg för att möjliggöra en exakt kontrollerad skärprocess av lungan. Även om det är nödvändigt att kyla explanterade lungan under en kort period för att möjliggöra en stelning av agaros matrisen är det möjligt att återgå till nära fysiologiska förhållanden för celler efter styckning rewarming av vävnaden. Detta framgår tydligt av våra data, vilket visar att under dessa förhållanden neutrofiler är mycket aktiva och uppvisar sin fulla potential som smidig fagocyter, som är nödvändiga för en effektiv clearance av en Aspergillus fumigatus infektion. De patrullerar lungorna passerar genom epiteliala hinder för att nå de inre delarna av alveolerna och vidare de aktivt tar upp svampsporer 11. En viktig slutsats av detta arbete var förekomsten av strukturer som liknar neutrofila extracellulärt fällor (NET) i Aspergillus-infekterade orgel. NET är en mycket nyligen upptäckt en ny försvarsmekanism i neutrofiler ^13. Men sedan dess inledande redogörelse 2004, har antalet fysiologiska eller patologiska tillstånd i djurmodeller och människor där detta fenomen har observerats eller saknas varit explosionsartat ökat ^14-16. Intressant, men så mycket arbete har lagts ner på dessa strukturer av så många olika grupper, de flesta rapporter är fortfarande på en mycket beskrivande nivå och inte mycket ärkänt om den mekanism NET utsläpp och dess reglering. Med våra protokoll kunde vi för första gången att visa NET fibrer i en smittad lunga. Dessutom kunde vi visa vikten av nyligen rekryterade neutrofiler samt molekylära svamp strukturer för deras förekomst eller hämning ^11. Detta visar tydligt potentialen i vår metod att undersöka enda steg NET bildas mer i detalj. Man kan tänka till exempel att använda neutrofila granulocyter från lämplig knock-out möss att observera deras förmåga NET bildas i adoptiv transfer experiment.

Även om den direkta observationen av neutrofila invandring från perifert blod är inte möjligt med detta system på grund av bristande blodtillförsel efter orgel borttagning, tror vi fortfarande att våra protokoll är ett värdefullt och relativt lätt att hantera tillvägagångssätt som gör det möjligt att avbilda tidigt eller sent steg i immunförsvaret mot infektioner i lungorna. Detta är därför ett viktigt steg mot att undersöka detta fenomen inom andas lunga av levande djur.