Summary
EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.
Abstract
Hydroxymethylation DNA הוא שינוי יודעים מזה זמן רב של ה-DNA, אך הפכה לאחרונה מוקד מחקר epigenetic. ה-DNA הוא שונה היונקים enzymatically במיקום פחמן 5 th של ציטוזין (C) שאריות עד 5-MC, ברובה בהקשר של dinucleotides CPG. 5-MC ניתנת חמצון אנזימטי עד 5-HMC ידי משפחת ט של אנזימים, אשר הם האמינו להיות מעורב בפיתוח ומחלות. נכון לעכשיו, התפקיד הביולוגי של 5-HMC לא מובנת לחלוטין, אך הוא יצירת עניין רב בשל הפוטנציאל שלה בתור סמן. זאת עקב מחקרים פורצי מספר זיהוי 5-hydroxymethylcytosine בעכבר גזע עובריים (ES) ותאי עצב.
שיטות מחקר, כולל שיטות bisulfite רצף, אינם מסוגלים להבחין בקלות בין 5-5-MC ו HMC. קיימים מספר פרוטוקולים שניתן למדוד כמויות גלובלית של 5-hydroxymethylcytosine בגנום, כולל כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה or כרומטוגרפיה שכבה דקה של נוקלאוזידים יחיד מתעכל מ-DNA הגנומי. נוגדנים המכוונים 5-hydroxymethylcytosine גם קיים, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח כתם נקודה, immunofluorescence, או משקעים של ה-DNA hydroxymethylated, אבל נוגדנים אלה אין תוספת יחיד resolution.In בסיס, ברזולוציה תלוי בגודל של ה-DNA immunoprecipitated ועבור ניסויים microarray, תלוי בעיצוב בדיקה. מאז לא ידוע היכן בדיוק 5-hydroxymethylcytosine קיים בגנום או תפקידה תקנה epigenetic, טכניקות חדשות נדרשים שניתן לזהות hydroxymethylation מוקד ספציפי. EpiMark 5-5-HMC ו MC ניתוח Kit מספקת פתרון להבחנה בין שני שינויים ב לוקוסים ספציפיים.
EpiMark 5-5-HMC ו MC ניתוח Kit היא שיטה פשוטה וחזקה לזיהוי ו quantitation של 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד DNA ספציפיים. גישה זו האנזימטית מנצל את ההפרש מתילציה הרגישות של MspI isoschizomers ו HpaII בפרוטוקול 3 שלבים פשוטים.
הדנ"א הגנומי של הריבית שטופלו T4-BGT, הוספת moeity הגלוקוז 5-hydroxymethylcytosine. תגובה זו רצף עצמאית, ולכן כל 5-HMC יהיה glucosylated, ללא שינוי או 5-MC-DNA המכיל לא יושפעו.
Glucosylation זה לאחר מכן על ידי עיכול endonuclease הגבלה. MspI ו HpaII להכיר אותו רצף (CCGG), אך רגישים מתילציה מדינות שונות. HpaII cleaves רק באתר ללא שינוי לחלוטין: כל שינוי (5-MC, 5-HMC או 5-ghmC) בשעה מחשוף או בלוקים ציטוזין. MspI מזהה cleaves 5-MC ו-5-HMC, אך לא 5-ghmC.
החלק השלישי של הפרוטוקול הוא חקירתו של מוקד על ידי PCR. משהו כמו 20 ng של DNA קלט ניתן להשתמש. הגברה של הניסוי (glucosylated ו מעוכל) שליטה (מדומה glucosylated ו מעוכל) DNA היעד עם primers איגוף אתר CCGG עניין (100-200 נקודות בסיס) מבוצע. אם האתר מכיל 5-CPG hydroxymethylcytosine, להקה מזוהה לאחר glucosylation ועיכול, אך לא התגובה הלא glucosylated הבקרה. זמן אמת PCR ייתן אומדן של כמה hydroxymethylcytosine נמצא באתר מיוחד זה.
בניסוי זה, ננתח את כמות 5-hydroxymethylcytosine במדגם עכבר Babl / C המוח על ידי נקודת הסיום PCR.
Protocol
1. ה-DNA Glucosylation בקרת תגובות
- בתוך צינור תגובה 1.5 למיליליטר על קרח, לערבב 50-10 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל), 12.4 מיקרוליטר של גלוקוז-UDP (ריכוז סופי של מיקרו 80), 31 מיקרוליטר של NEBuffer 4 עד 310 מיקרוליטר nuclease ללא מים להביא את הנפח הכולל עד 310 מיקרוליטר.
- פיצול זה תערובת התגובה לשני צינורות של 155 מיקרוליטר אחד.
- ואז להוסיף 30 יחידות, או 3 מיקרוליטר, של T4-β-glucosyltransferase אל צינור אחד. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. הצינור השני הוא תגובה מלאה, אז להוסיף 3 מיקרוליטר של מים, במקום T4-BGT.
- דגירה שני צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 18 שעות, במהלכן T4-BGT יוסיף גלוקוז לקבוצת הידרוקסיל של 5-hydroxymethylcytosine קבוצות המדגם.
2. אנזים הגבלה עיכול
- Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות המספרים 1 עד 3. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל תגובה.
- Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות מספרים 4 עד 6. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל בקרה.
- הוספת 100 יחידות, או 1 microliter, של MspI לתוך צינורות 1 ו -4. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
- הוספת 50 יחידות, או 1 microliter, של HpaII לתוך צינורות 2 ו -5. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
- אל תוסיף כלום צינורות 3 ו - 6, כפי שהם שולטת.
- דגירה כל 6 צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
- הוסף 1 microliter של proteinase K לתוך הצינור כל לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- להשבית K proteinase ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. ניתוח ה-DNA על ידי ה-PCR / qPCR
פרוטוקול זה משתמש LongAmp חוד של תקי עבור נקודת הסיום PCR אשר הוכח מתפקדים היטב. פרוטוקולים אחרים PCR ניתן להחליף.
- מוסיפים את הרכיבים הבאים אל צינור 0.2 PCR התגובה למיליליטר על הקרח: 10 מיקרוליטר של הצפת התגובה 5X תקי LongAmp, 1.5 מיקרוליטר של 10 dNTPs millimolar, 1 microliter של מיקרו פריימר 10 קדימה, 1 microliter של פריימר 10 הפוך מיקרו, 3 מיקרוליטר של תבנית ה-DNA מן השלבים הקודמים, 1 microliter של פולימראז הדנ"א תקי LongAmp ו nuclease ללא מים עד 50 מיקרוליטר. כרכים אלה עשויים להשתנות על פי פרוטוקול ה-PCR בשימוש.
- לערבב בעדינות את התגובה. במידת הצורך, לאסוף את כל נוזל אל החלק התחתון של הצינור על ידי ספין מהיר.
- כיסוי המדגם עם שמן מינרלי אם באמצעות thermocycler ללא מכסה מחומם.
- העברת צינורות PCR מן הקרח thermocycler עם לחסום את שחומם מראש ל 94 מעלות צלזיוס להפעיל את תוכנית רכיבה על אופניים. עבור לשגרה 3-PCR צעד, לא אמורה להיות צעד אחד denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס denaturation למשך 15 שניות, 55-65 מעלות צלסיוס חישול למשך 30 שניות, ו - 65 מעלות צלסיוס הארכה למשך 20 שניות, או 50 שניות לכל kb. זו צריכה להיות מלווה הארכה אחת אחרונה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בזמן אמת PCR ניתן גם לבצע כדי לכמת את הסכומים של 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine. עיין במדריך המוצר, נמצא על neb.com למידע ספציפי.
4. נציג תוצאות:
באיור 1. השוואה בין 5-hydroxymethylcytosine בסכומים מוקד 12 ב שונה Balb / C דגימות רקמות העכבר. (א), נקודת הסיום PCR. (ב), בזמן אמת PCR.
ה-DNA מארבע רקמות העכבר נותח. לצורך ההשוואה, בזמן אמת PCR היו נתונים מנורמל ל-DNA נימול. עקומת סטנדרט היה בשימוש כדי לקבוע מספר עותק. הדגימות יכול להיות מנורמל על ידי חלוקת מספר עותק של דגימות לא 1-6 במספר עותק של שליטה כי הוא לא מעוכלים (לא 5). מסלול ג'ל Boxed מראה וריאציה בהווה 5-HMC.
Discussion
יש דברים קריטיים מספר לשקול בעת הגדרת הניסוי הזה. ראשית, חשוב כי glucosylation של הדנ"א הגנומי ממשיך סיום. סגוליות רצף של T4-BGT לא ידוע, וזה כנראה ברירה לרצף את המצע. לכן, במקרים מסוימים, פעמים הדגירה כבר עשוי להיות נחוץ. עיכול שנית, MspI ו HpaII חייב להיות שלם כדי למנוע אות הרקע. עבור אלה אנזימי הגבלה, אנו ממליצים זמן הדגירה של 4 שעות, אבל incubations כבר יכול להתבצע כאשר מחשוף שלם הוא ציין. שלישית, כמות ה-DNA קלט יכול להיות מותאם בהתאם לזמינות, מאז 20 NGS של דנ"א יכולה לשמש נקודת הסיום PCR. לבסוף, אנו ממליצים על השימוש של ה-DNA לשלוט מסופק שניתן להריץ במקביל הדנ"א הגנומי של 5-MC ו-5-HMC כימות.
Disclosures
גם טד בצוענים, המחברים של מאמר זה, הם עובדי חוד; בצוענים היא המפתחת העיקרית של הערכה, עם טד להיות מנהל מחלקת פיתוח יישומים אשר פיקח על פיתוח של הערכה זו.
Acknowledgments
Sriharsa Pradhan, שאנון מורי קיני, חכה צ'ין Gyeong, Jurate Bitinaite, יו 'נג, פייר אוליבייה Esteve, Romualdas Vaisvila, מעבדה סטיבן א' s ג'ייקובסן, UCLA. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH 1R44GM095209-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | |
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | ||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | |
| molecular biology grade water |
References
- Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
- Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
- Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).
