Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

Summary

EpiMark 5-HMC и 5-тС Анализ Kit может быть использован для анализа и количественного 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine в специально cific локуса. Комплект отличается 5-тС из 5-HMC добавлением глюкозы в гидроксильные группы 5-HMC через ферментативной реакции использованием β-glucosyltransferase (Т4-BGT). Когда 5-HMC происходит в контексте КСДУ, эта модификация превращает расщепляемого сайт MspI к не-расщепляемого сайта.

Protocol

1. Glucosylation ДНК и контроля реакции

1. В 1,5 мл реакционной трубы на лед, перемешать 5-10 мкг геномной ДНК (для конечной концентрации 30 мкг / мл), 12,4 мкл UDP-глюкозы (для конечной концентрации 80 мкмоль), 31 мкл NEBuffer 4 и до 310 мкл нуклеазы без воды довести общий объем до 310 мкл.
2. Сплит этой реакционной смеси на две трубы из 155 мкл каждого из них.
3. Затем добавить 30 единиц, или 3 мкл, Т4-β-glucosyltransferase к одной трубке. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Вторая трубка контрольной реакции, так что добавьте 3 мкл воды, вместо того, Т4-BGT.
4. Инкубируйте обе трубки на 37 градусов по Цельсию в течение 12 до 18 часов, в течение которых Т4-BGT добавят глюкозы гидроксильные группы 5-hydroxymethylcytosine групп в образце.

2. Пищеварение рестрикции

1. Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы цифры от 1 до 3. Алиготе 50 мкл реакционной смеси в каждую.
2. Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы номера с 4 по 6. Алиготе 50 мкл контроля смесь в каждом.
3. Добавить 100 единиц, или на 1 мкл, из MspI в пробирки 1 и 4. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз.
4. Добавить 50 единиц, или на 1 мкл, из HpaII в пробирки, 2 и 5. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз.
5. Не добавляйте ничего, чтобы трубы 3 и 6, так как они являются элементами управления.
6. Инкубируйте всех 6 труб при температуре 37 градусов по Цельсию в течение не менее 4 часов.
7. Добавить 1 мкл протеиназы К в каждую пробирку и инкубировать при температуре 40 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
8. Инактивировать протеиназы К путем инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.

3. Анализ ДНК методом ПЦР / КПЦР

Этот протокол использует NEB в LongAmp Taq для конечной точки ПЦР, который был проявлен к хорошей работе. Другие протоколы ПЦР могут быть заменены.

1. Добавьте следующие компоненты в 0,2 мл ПЦР-реакции пробирку на льду: 10 мкл 5X LongAmp Taq реакционного буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1 мкл 10 мкмоль прямого праймера, 1 мкл 10 мкмоль Primer назад, 3 мкл шаблон ДНК из предыдущих шагов, 1 микролитр LongAmp ДНК-полимеразы Taq и нуклеазы без воды до 50 мкл. Эти объемы могут меняться в зависимости от используемого протокола ПЦР.
2. Аккуратно перемешайте реакции. При необходимости собрать все жидкости в нижней части трубы быстро вращаться.
3. Наложение образца с минеральным маслом при использовании амплификаторе без подогревом крышкой.
4. Передача пробирки для ПЦР изо льда в Термоциклер с блока предварительно нагретую до 94 градусов по Цельсию и начать езда на велосипеде программы. Для рутинной 3-х ступенчатый ПЦР, должен быть один первый шаг денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 30 секунд, затем 30 циклов 94 градусов Цельсия денатурации в течение 15 секунд, от 55 до 65 градусов Цельсия отжига в течение 30 секунд, и 65 градусов по Цельсию расширение в течение 20 секунд, или 50 секунд кб. Это должно сопровождаться одним последним продлением на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут. ПЦР в реальном времени также может быть выполнена для количественного определения количества 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководством по продукции, найденный на neb.com конкретной информации.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Сравнение 5-hydroxymethylcytosine суммы в локусе 12 в другую мышь Balb / C образцы тканей. (А), конечного точки ПЦР. (B), ПЦР в реальном времени.

ДНК из четырех тканях мышей были проанализированы. Для сравнения, ПЦР в реальном времени данные были нормированы на режиссерский ДНК. Стандартная кривая была использована для определения количества копий. Образцы могут быть нормализованы путем деления количества копий образцов не по 1-6 числа копий управления, непереваренные (№ 5). Штучной упаковке полосы геля показано изменение в 5-HMC настоящее время.

Discussion

Есть несколько важных вещей, чтобы рассмотреть при создании этого эксперимента. Во-первых, важно, чтобы glucosylation геномной ДНК переходит к завершению. Последовательность Специфичность Т4-BGT не известно, и это, кажется, нет другого выбора, для подложки последовательности. Поэтому в некоторых случаях более длительное время инкубации может быть необходимым. Во-вторых, MspI и HpaII пищеварения должна быть полной, чтобы избежать фонового сигнала. Для этих ферментов рестрикции, мы рекомендуем инкубации в течение 4 часов, но больше инкубации могут быть выполнены при неполном расщеплении наблюдается. В-третьих, количество входных ДНК может быть скорректирован в зависимости от доступности, с 20 NGS ДНК может быть использована для конечной точки ПЦР. Наконец, мы рекомендуем использовать поставляемые контроль ДНК, которые могут работать параллельно с геномной ДНК в течение 5-MC и 5-HMC количественной оценке.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water