Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Summary

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Abstract

DNA Hydroxymethylierung ist eine lange bekannte Modifizierung von DNA, aber seit kurzem ein Schwerpunkt in der epigenetischen Forschung. Mammalian DNA wird enzymatisch an der 5 ^th Kohlenstoff-Position von Cytosin (C)-Reste bis 5-mC geändert, überwiegend im Zusammenhang mit der CpG-Dinukleotide. 5-mC zugänglich ist enzymatische Oxidation zu 5-HMC von der Tet-Familie von Enzymen, die vermutlich in Entwicklung und Krankheit beteiligt sind. Derzeit ist die biologische Rolle von 5-HMC nicht vollständig verstanden, sondern ist auf großes Interesse, da ihr Potential als Biomarker. Dies ist auf mehrere bahnbrechende Studien zu identifizieren 5-Hydroxymethylcytosin in embryonalen Maus-Stammzellen (ES) und neuronalen Zellen.

Forschung Techniken, einschließlich Bisulfit-Sequenzierung Methoden sind nicht in der Lage, problemlos zwischen 5-mC-und 5-hmc unterscheiden. Ein paar Protokolle existieren, die Gesamtbeträge von 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom zu messen, einschließlich Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Analyse oder Dünnschichtchromatographie einzelner Nucleoside aus genomischer DNA verdaut gekoppelt. Antikörper, die auf 5-Hydroxymethylcytosin gibt es auch, die für Dot-Blot-Analyse, Immunfluoreszenz oder Fällung von hydroxymethylierten DNA verwendet werden, können aber diese Antikörper nicht haben Einzel-Basis resolution.In Darüber hinaus hängt die Auflösung auf die Größe des immunpräzipitiert DNA und für Microarray-Experimenten, hängt davon ab, Sonde Design. Da nicht bekannt ist, wo genau 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom oder seine Rolle in der epigenetischen Regulation existiert, sind neue Techniken erforderlich, die spezifischen Locus Hydroxymethylierung identifizieren. Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit bietet eine Lösung für die Unterscheidung zwischen diesen beiden Änderungen an bestimmten Orten.

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit ist eine einfache und robuste Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von 5-Methyl-und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb eines bestimmten DNA-Locus. Diese enzymatische Ansatz nutzt die Differential-Methylierung Empfindlichkeit des Isoschizomere MspI und HpaII in einer einfachen 3-Schritt-Protokoll.

Genomic DNA von Interesse ist mit T4-BGT behandelt, indem eine Glukose moeity bis 5-Hydroxymethylcytosin. Diese Reaktion ist Sequenz-unabhängige, also alle 5-HMC glucosylierten werden; unmodifizierte oder 5-mC mit DNA wird dadurch nicht beeinflusst.

Diese Glucosylierung wird dann durch Restriktionsendonukleaseverdau gefolgt. MspI und HpaII erkennen die gleiche Sequenz (CCGG), sind aber empfindlich auf unterschiedliche Methylierung Staaten. HpaII spaltet nur einen komplett unveränderten Ort: jede Änderung (5-mC, 5-HMC-oder 5-ghmC) an beiden Cytosin-Blöcke Spaltung. MspI erkennt und schneidet 5-mC-und 5-HMC, aber nicht 5-ghmC.

Der dritte Teil des Protokolls ist eine Abfrage der Locus durch PCR. So wenig wie 20 ng der DNA-Eingang genutzt werden kann. Verstärkung der experimentellen (glucosylierten und verdaut) und Kontrolle (mock glucosylierten und verdaut) Ziel-DNA mit Primer flankieren CCGG Ort von Interesse (100-200 bp) durchgeführt wird. Wenn der CpG site enthält 5-Hydroxymethylcytosin, ist eine Band nach Glucosylierung und Verdauung erkannt, aber nicht in den nicht-glucosylierten Kontroll-Reaktion. Real-time PCR gibt eine Annäherung, wie viel Hydroxymethylcytosin ist in diesem besonderen Ort.

In diesem Experiment werden wir die 5-Hydroxymethylcytosin Betrag in eine Maus Babl / C Gehirn Probe zu analysieren, indem Endpunkt PCR.

Protocol

1. DNA Glucosylierung and Control Reaktionen

1. In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß auf Eis mischen 5-10 Mikrogramm der genomischen DNA (für eine endgültige Konzentration von 30 Mikrogramm / Milliliter), 12,4 Mikroliter UDP-Glucose (für eine endgültige Konzentration von 80 Mikromol), 31 Mikroliter NEBuffer 4 und bis zu 310 Mikroliter Nuklease-freies Wasser zu bringen das Gesamtvolumen auf 310 Mikroliter.
2. Split dieses Reaktionsgemisch in zwei Röhren von 155 Mikroliter jeder.
3. Dann fügen Sie 30 Einheiten oder 3 Mikroliter, der T4-β-glucosyltransferase zu einer Röhre. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Die zweite Röhre wird der Kontroll-Reaktion, so fügen Sie 3 Mikroliter Wasser anstelle von T4-BGT.
4. Inkubieren beiden Röhren bei 37 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden, während welcher Zeit der T4-BGT wird Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-Hydroxymethylcytosin Gruppen in der Probe hinzufügen.

2. Restriktionsenzymverdau

1. Label drei 0,2 ml PCR-Streifen Rohre Nummern 1 bis 3. Aliquot 50 ul des Reaktionsgemisches in jedem.
2. Label drei 0,2 ml PCR-Streifen Rohre Nummern 4 bis 6 aus. Aliquot 50 ul der Kontrolle Mischung in jeder.
3. Add 100 Einheiten, oder 1 Mikroliter, der MspI in Röhrchen 1 und 4. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren.
4. Fügen Sie 50 Einheiten, oder 1 Mikroliter, der HpaII in Rohren 2 und 5. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren.
5. Fügen Sie nicht etwas zu Röhrchen 3 und 6, da sie steuert werden.
6. Inkubieren Sie alle 6 Röhren bei 37 Grad Celsius für mindestens 4 Stunden.
7. Add 1 Mikroliter Proteinase K in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten.
8. Inaktivierung der Proteinase K durch Inkubation bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten.

3. Analysieren DNA durch PCR / qPCR

Dieses Protokoll verwendet NEB ist LongAmp Taq für Endpunkt PCR, die gezeigt worden ist, eine gute Leistung. Andere PCR-Protokolle ersetzt werden können.

1. Fügen Sie die folgenden Komponenten, um eine 0,2 Milliliter PCR-Reaktionsgefäß auf Eis: 10 Mikroliter 5X LongAmp Taq-Reaktionspuffer, 1,5 Mikroliter 10 mM dNTPs, 1 Mikroliter von 10 Mikromol Vorwärtsprimer, 1 Mikroliter von 10 Mikromol Reverse-Primer, 3 Mikroliter Vorlage DNA aus den vorherigen Schritten, 1 Mikroliter LongAmp Taq DNA Polymerase und Nuklease-freies Wasser bis zu 50 Mikroliter. Diese Mengen können je nach PCR-Protokoll zu ändern.
2. Vorsichtig mischen die Reaktion. Wenn nötig, sammeln Sie alle Flüssigkeit auf den Boden der Röhre durch eine schnelle Runde.
3. Overlay der Probe mit Mineralöl bei Verwendung eines Thermocycler ohne Heizdeckel.
4. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen von Eis zu einem Thermocycler mit dem Block vorgeheizt auf 94 Grad Celsius und starten Sie den Radsport-Programm. Für eine Routine 3-Schritt-PCR, sollte es eine initiale Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 30 Sekunden von 30 Zyklen von 94 Grad Celsius Denaturierung für 15 Sekunden, 55 bis 65 Grad Celsius Annealing für 30 Sekunden und 65 Grad Celsius Erweiterung folgen für 20 Sekunden oder 50 Sekunden pro kb. Dies sollte durch eine letzte Verlängerung bei 65 Grad Celsius für 5 Minuten eingehalten werden. Real-time PCR kann auch durchgeführt werden, um Mengen von 5-Methyl-und 5-Hydroxymethylcytosin quantifizieren sein. Bitte beachten Sie die Produkt-Handbuch, auf neb.com gefunden für spezifische Informationen.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Vergleich von 5-Hydroxymethylcytosin Mengen an Locus 12 in verschiedenen Maus Balb / C Gewebeproben. (A), End-Point-PCR. (B), Real time PCR.

DNA aus vier Mausgeweben analysiert. Zum Zwecke der Vergleichbarkeit wurden real time PCR Daten uncut DNA normalisiert. Eine Standardkurve wurde verwendet, um die Nummer des Exemplars zu bestimmen. Die Proben konnten, indem man die Kopienzahl der Proben No 1-6 durch die Kopienzahl der Kontrolle, ist unverdaut (Nr. 5) normalisiert werden. Boxed Gelspur zeigt Variante in 5-HMC präsentieren.

Discussion

Es gibt einige kritische Dinge zu beachten bei der Einrichtung dieses Experiment. Zunächst ist es wichtig, dass die Glucosylierung der genomischen DNA vollständig verläuft. Die Sequenz-Spezifität der T4-BGT ist nicht bekannt, und es scheint keine andere Wahl für das Substrat Folge haben. Daher ist in einigen Fällen kann längere Inkubationszeiten notwendig sein. Zweitens MspI und HpaII Verdauung muss, um Hintergrund-Signal zu vermeiden abzuschließen. Für diese Restriktionsenzyme, empfehlen wir eine Inkubationszeit von 4 Stunden, aber mehr Inkubationen können durchgeführt werden, wenn unvollständige Spaltung beobachtet werden. Drittens kann Input DNA-Menge angepasst je nach Verfügbarkeit, seit 20 ngs der DNA für die Endpunkt-PCR verwendet werden kann. Schließlich empfehlen wir die Nutzung der mitgelieferten Kontroll-DNA, die parallel mit genomischer DNA für 5-mC und 5-HMC Quantifizierung kann ausgeführt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water