Summary
يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.
Protocol
1. Glucosylation الحمض النووي ومراقبة ردود الفعل
- في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر على الجليد ، مزيج 50-10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني (لتركيز النهائي 30 ميكروغرام / ملليلتر) ، 12.4 microliters من UDP - الجلوكوز (لتركيز النهائي من 80 micromolar) ، و 31 من microliters NEBuffer 4 وتصل إلى 310 microliters nuclease خالية من المياه لتحقيق الحجم الكلي إلى 310 microliters.
- تقسيم هذا الخليط التفاعل إلى أنبوبين من 155 microliters لكل منهما.
- ثم إضافة 30 وحدة ، أو microliters 3 من T4 - ناقلة الغلوكوزيل - β لأنبوب واحد. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. الأنبوب الثاني هو رد فعل السيطرة ، إضافة لذلك microliters 3 من المياه ، بدلا من BGT - T4.
- احتضان كل من أنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة ، وخلال الوقت الذي T4 - BGT سيضيف الجلوكوز إلى مجموعة الهيدروكسيل من 5 hydroxymethylcytosine المجموعات في العينة.
2. تقييد انزيم الهضم
- التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط الأرقام من 1 إلى 3 أنابيب. قسامة 50 من المجاهدين في كل خليط التفاعل.
- التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط أعداد أنابيب من 4 إلى 6. قسامة 50 ماي من خليط التحكم في كل منها.
- إضافة 100 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من MspI في أنابيب 1 و 4. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
- إضافة 50 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من HpaII في أنابيب 2 و 5. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
- لا تضيف شيئا إلى أنابيب 3 و 6 ، كما هي الضوابط.
- احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
- إضافة 1 ميكروليتر من بروتين كاف في كل أنبوب واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تثبيط بروتين التي يحتضنها K في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
3. تحليل الحمض النووي عن طريق PCR / qPCR
يستخدم هذا البروتوكول في NEB LongAmp طق لنقطة النهاية PCR وهو ما ثبت لأداء جيدا. يمكن أن تكون بديلا غيرها من البروتوكولات PCR.
- إضافة المكونات التالية لأنبوب 0.2 ملليلتر تفاعل PCR على الجليد : 10 microliters من 5X LongAmp الاحتياطي الرد طق ، 1.5 microliters من 10 dNTPs millimolar ، 1 ميكروليتر التمهيدي من 10 انتقل micromolar ، 1 ميكروليتر من 10 عكس micromolar التمهيدي و 3 من قالب microliters الحمض النووي من الخطوات السابقة ، 1 ميكروليتر من البلمرة DNA LongAmp طق ، وخالية من المياه nuclease تصل إلى 50 microliters. قد تتغير هذه الكميات وفقا لبروتوكول PCR المستخدمة.
- المزيج بلطف التفاعل. إذا لزم الأمر ، وجمع كل السائل إلى أسفل الأنبوب التي تدور بسرعة.
- تراكب العينة مع الزيوت المعدنية في حالة استخدام thermocycler دون غطاء ساخنة.
- نقل أنابيب PCR من الجليد لthermocycler مع الكتلة محمى إلى 94 درجة مئوية وبدء برنامج ركوب الدراجات. لروتين 3 - PCR الخطوة ، ينبغي أن تكون هناك خطوة واحدة تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمسخ و 55 إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية الصلب ، و 65 درجة مئوية التمديد لمدة 20 ثانية ، أو 50 ثانية لكل كيلوبايت. وينبغي أن يتبع ذلك من قبل أحد التمديد النهائي في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن أيضا في الوقت الحقيقي PCR أن يؤديها لquantitate مبالغ methylcytosine - 5 و 5 hydroxymethylcytosine. يرجى الرجوع إلى دليل المنتجات ، والعثور على neb.com عن معلومات محددة.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. مقارنة بين 5 - hydroxymethylcytosine المبالغ في 12 موضعا في عينات الأنسجة المختلفة الماوس BALB / C. (A) ، نقطة النهاية PCR. (B) ، في الوقت الحقيقي PCR.
وقد تم تحليل الحمض النووي من الأنسجة الماوس الأربعة. لأغراض المقارنة ، تم تطبيع PCR الوقت الحقيقي للبيانات الحمض النووي غير المصقول. واستخدمت لتحديد المنحنى القياسي في عدد النسخ. ويمكن تطبيع عينات بقسمة عدد نسخ أي من العينات 1-6 قبل عدد نسخة من التحكم الذي هو عسر الهضم (رقم 5). محاصر حارة هلام يظهر التباين في 5 HMC الحالي.
Discussion
هناك أشياء عدة حاسمة في الاعتبار عند إعداد هذه التجربة. أولا ، من المهم أن glucosylation من الحمض النووي الجينومي العائدات على الانتهاء. ولا يعرف خصوصية تسلسل BGT - T4 ، ويبدو أن لا خيار لتسلسل الركيزة. ولذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة. ثانيا ، يجب MspI HpaII الهضم وتكون كاملة من أجل تجنب إشارة الخلفية. لتقييد هذه الإنزيمات ، نوصي وقت الحضانة من 4 ساعات ، ولكن لا يمكن أن يؤديها يعد حضانات عندما لوحظ انقسام غير مكتملة. ثالثا ، يمكن تعديلها إدخال كمية الحمض النووي اعتمادا على توافر ، يمكن استخدامها منذ 20 NGS من الحمض النووي لنقطة النهاية PCR. وأخيرا ، فإننا نوصي باستخدام الحمض النووي التحكم الموردة والتي قد تكون بالتوازي مع الحمض النووي الجيني لMC - 5 - 5 وتقدير مؤسسة حمد الطبية.
Disclosures
كل من تيد والغجر ، والمؤلفين من هذه المادة ، والعاملين في NEB ؛ الغجر هي المطور الرئيسي للمجموعة ، مع تيد يجري مدير قسم التطوير والتطبيقات التي أشرفت على إعداد هذه المجموعة.
Acknowledgments
Sriharsa برادان ، شانون موري كيني ، هانغ كيونغ شين ، Jurate Bitinaite ، يو تشنغ ، بيير اوليفييه استيف Romualdas Vaisvila ، والمختبرات ستيفن هاء جاكوبسن ثانية ، جامعة كاليفورنيا. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R44GM095209 - 01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | |
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | ||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | |
| molecular biology grade water |
References
- Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
- Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
- Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).
