BALB / C脑组织中的高灵敏度检测5 - hydroxymethylcytosine

Summary

EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件，可用于分析和定量内SPE太平洋轨迹的5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine。该试剂盒区别于5 HMC 5 - MC除了通过对葡萄糖的酶，利用β-葡萄糖（T4 - BGT）反应羟基组的5 HMC。当5 HMC在CCGG背景下发生，这种修改裂解MSPI网站转换成非裂解网站。

Abstract

DNA羟甲基化是一个久负盛名的DNA修饰，但最近已成为表观遗传学研究的重点。哺乳动物的DNA酶修饰的5 ^个碳的位置，胞嘧啶（C）残留5 - MC，他们主要在CpG二核苷酸中。 5 - MC是服从酶氧化酶的春节家庭，这被认为是涉及发育和疾病5 - HMC。目前，5 HMC的生物作用是不完全理解，但产生了很多的利益，由于其作为生物标志物的潜力。这是由于几个开创性的研究确定，在小鼠胚胎干（ES）和神经细胞的5 - hydroxymethylcytosine。

研究技术，包括重亚硫酸盐测序方法，是无法容易分辨5 - MC和5 HMC。几个协议存在，可以衡量全球基因组中的5 - hydroxymethylcytosine的金额，包括液相色谱与质谱分析或薄层色谱法从基因组DNA消化的单核苷，的。抗体，目标5 - hydroxymethylcytosine也存在，可用于点杂交分析，免疫荧光，或羟甲基化的DNA沉淀，但这些抗体不具备单基地resolution.In此外，分辨率取决于免疫沉淀的DNA的大小和微阵列实验，取决于探头设计。由于它是未知的5 hydroxymethylcytosine在基因组的表观遗传调控中的作用存在的确切位置，新技术，它可以识别位点的具体羟甲基。 EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件提供了一个区分在特定位点的这两个修改的解决方案。

EpiMark 5 HMC和5 - MC分析套件是为5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine在一个特定的DNA位点的识别和定量分析的简单和可靠的方法。这种酶的方法，利用同裂酶MSPI和HpaII差甲基化的敏感性，在一个简单的3步协议。

被视为与T4 - BGT感兴趣的基因组DNA，加入葡萄糖moeity 5 hydroxymethylcytosine。这种反应是序列独立的，因此所有5 - HMC将glucosylated;未修改或5 - MC含有DNA不会受到影响。

这glucosylation是随后由酶切。 MSPI和HpaII认识到相同的序列（CCGG），但不同的甲基化状态很敏感。 HpaII切割只有一个完全未修改的网站：任何修改或者胞嘧啶块裂解（5 - MC，5 HMC或5 ghmC）。 MSPI识别和切割5 - MC和5 HMC，但不是5 ghmC。

该协议的第三部分是通过PCR的轨迹审讯。可用于输入DNA低至20纳克。实验（glucosylated和消化）和控制（模拟glucosylated和消化）的目标与侧翼利益CCGG网站（100-200 BP）引物的DNA进行扩增。如果中央人民政府网站包含5 hydroxymethylcytosine，带检测glucosylation和消化后，但不能在非glucosylated控制反应。实时PCR将在这个特殊的网站是多少hydroxymethylcytosine逼近。

在这个实验中，我们将分析终点PCR方法在小鼠BABL / C大脑样本5 hydroxymethylcytosine金额。

Protocol

1。 DNA Glucosylation和控制反应

1. 在反应管上冰的1.5毫升，混合5-10微克的基因组DNA（终浓度为30微克/毫升），12.4微升UDP -葡萄糖（终浓度为80微摩尔），31 NEBuffer 4微升高达310微升无核酸酶水带来的总体积310微升。
2. 拆分成两个，每管155微升反应混合物。
3. 然后添加30个单位，或3微升的T4 -β-葡萄糖，一管。向上和向下轻轻吹打混合。第二管是控制反应，所以加水3微升，而不是T4 - BGT。
4. 孵育都管，在37度摄氏12至18小时，在此期间，T4 - BGT将增加葡萄糖的5 hydroxymethylcytosine组样品中的羟基组。

2。限制性内切酶消化

1. 三个标签0.2毫升PCR条管1至3号。分装到每个反应混合物50 UL。
2. 三个标签0.2毫升PCR条管4至6号。 UL混合控制到每一个分装50。
3. 添加到试管1和4 100个单位，或MSPI 1微升。向上和向下轻轻吹打混合。
4. 添加到管2和5的50个单位，或HpaII 1微升。向上和向下轻轻吹打混合。
5. 不要添加任何管3和6，因为他们控制。
6. 至少4个小时，在37摄氏度孵育的所有6个管。
7. 添加到每管1微升的蛋白酶K孵育30分钟，摄氏40度。
8. 灭活蛋白酶K孵育10分钟，摄氏95度。

3。分析DNA PCR / qPCR的

该协议使用，NEB的LongAmp Taq酶终点PCR这已被证明表现良好。可以取代其他PCR检测。

1. 在冰上0.2毫升PCR反应管：10微升5X LongAmp Taq酶反应缓冲液，1.5微升，10毫摩尔dNTPs，1微升10微摩尔正向引物，1微升10微摩尔的反向引物，3微升模板添加下列组件从前面的步骤，LongAmp Taq DNA聚合酶1微升，无核酸酶水至50微升的DNA。根据PCR的协议，用于这些卷可能会改变。
2. 轻轻地混合反应。如果有必要，收集所有液体的试管底部，由快速旋转。
3. 与矿物油覆盖的样本，没有加热的盖子，如果使用一个热循环。
4. PCR管冰转移到一个热循环与预热到94摄氏度的块，并开始循环程序。例行3步PCR，应在94摄氏度的初始变性30秒，30个循环94度摄氏变性15秒，55至65度摄氏30秒退火，延伸度和65摄氏度的步骤20秒或50秒每KB。这之后，应在65度摄氏5分钟的最后一次延长。实时PCR也可以进行定量5 - 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine金额。请参考产品使用说明书，在neb.com发现特定的信息。

4。代表性的成果：

图1 5 hydroxymethylcytosine金额在12位点的比较不同的小鼠BALB / C组织样本。 （一），终点PCR扩增。 （二），实时PCR。

从四个小鼠组织DNA进行了分析。为便于比较，未切割DNA的实时PCR数据正常化。标准曲线来确定套数。未消化的控制的拷贝数（5）除以样品没有1-6的拷贝数的样品可以归。盒装凝胶泳道显示在5 HMC目前的变化。

Discussion

设立这个实验时，有几个关键的事情要考虑。首先，它是非常重要的基因组DNA glucosylation收益来完成。 T4 - BGT序列特异性是不为人所知，并且，它似乎已经为基材序列别无选择。因此，在某些情况下，潜伏期较长时间，可能是必要的。其次，MSPI和HpaII消化必须是完整的，以避免背景信号。对于这些限制性内切酶，我们推荐的4个小时的潜伏期的时间，但不完全卵裂是观察时，可以进行较长的孵化。第三，输入DNA量可以调整取决于可用性，自20农工商超市的DNA可用于终点PCR。最后，我们建议使用提供的对照DNA，这可能是基因组DNA的同时运行5 - MC和5 - HMC量化。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water