Summary
Den EpiMark 5-HMC och 5-MC Analysis Kit kan användas för att analysera och kvantifiera 5-methylcytosine och 5-hydroxymethylcytosine inom ett spe specifika locus. Satsen skiljer 5-MC från 5-HMC genom tillsats av glukos till hydroxylgrupp av 5-HMC via en enzymatisk reaktion använda β-glucosyltransferase (T4-BGT). När 5-HMC sker i samband med CCGG, omvandlar denna modifiering ett cleavable MSPI webbplats till en icke-cleavable webbplats.
Abstract
DNA hydroxymethylation är ett länge känt modifiering av DNA, men har nyligen blivit ett fokus på epigenetisk forskning. Däggdjur DNA är enzymatiskt ändras på 5: e kolet ställning cytosin (C) rester till 5-MC, huvudsakligen i samband med CpG dinucleotides. 5-MC är mottaglig för enzymatisk oxidering till 5-HMC av Tet familjen av enzymer, som tros vara inblandade i utveckling och sjukdom. För närvarande är den biologiska rollen av 5-HMC inte helt klarlagda, men genererar ett stort intresse på grund av dess potential som en biomarkör. Detta beror på flera banbrytande studier identifiera 5-hydroxymethylcytosine i mus embryonala stamceller (ES) och neuronala celler.
Forskning tekniker, inklusive bisulfite sekvensering metoder, inte att enkelt skilja mellan 5-MC och 5-HMC. Några protokoll finns som kan mäta totala belopp av 5-hydroxymethylcytosine i arvsmassan, inklusive vätskekromatografi kopplat till masspektrometri analys eller tunnskiktskromatografi av enstaka nukleosider rötas från arvsmassans DNA. Antikroppar som riktar 5-hydroxymethylcytosine finns också, som kan användas för dot blot analys, immunofluorescens eller utfällning av hydroxymethylated DNA, men dessa antikroppar har inte enda förutom bas resolution.In beror resolution om storleken på immunoprecipitated DNA och för microarray experiment, beror på sond design. Eftersom det är okänt exakt där 5-hydroxymethylcytosine finns i arvsmassan och dess roll i epigenetisk reglering, nya tekniker behövs som kan identifiera lokus specifika hydroxymethylation. Den EpiMark 5-HMC och 5-MC Analysis Kit erbjuder en lösning för att skilja mellan dessa två ändringar på specifika loci.
Den EpiMark 5-HMC och 5-MC Analysis Kit är en enkel och robust metod för identifiering och kvantifiering av 5-methylcytosine och 5-hydroxymethylcytosine inom en viss DNA-lokus. Detta enzymatisk metod utnyttjar känsligheten differential metylering av isoschizomers MSPI och HpaII i en enkel 3-stegs-protokollet.
Genomiskt DNA av intresse behandlas med T4-BGT, lägga en glukos moeity till 5-hydroxymethylcytosine. Denna reaktion är sekvens-oberoende, därför alla 5-HMC kommer att glucosylated, omodifierade eller 5-MC som innehåller DNA kommer inte att påverkas.
Detta glucosylation följs sedan av begränsning endonuclease matsmältningen. MSPI och HpaII igen samma sekvens (CCGG) men är känsliga för olika metylering stater. HpaII klyver bara en helt omodifierad sajt: några ändringar (5-MC, 5-HMC eller 5-ghmC) på antingen cytosin block klyvning. MSPI erkänner och klyver 5-MC och 5-HMC, men inte 5-ghmC.
Den tredje delen av protokollet förhör av locus med PCR. Så lite som 20 ng ingång DNA kan användas. Förstärkning av den experimentella (glucosylated och smält) och kontroll (håna glucosylated och smält) mål-DNA med primers flankerande en CCGG plats av intresse (100-200 bp) utförs. Om CpG webbplatsen innehåller 5-hydroxymethylcytosine, är ett band upptäcks efter glucosylation och matsmältning, men inte i den icke-glucosylated kontroll reaktion. Real time PCR kommer att ge en uppskattning av hur mycket hydroxymethylcytosine är i detta viss webbplats.
I detta experiment kommer vi att analysera 5-hydroxymethylcytosine belopp i en mus Babl / C hjärnan provet genom slutpunkt PCR.
Protocol
1. DNA Glucosylation och styra reaktioner
- I ett 1,5 ml reaktionsrör på is, blanda 50-10 mikrogram arvsmassans DNA (för en slutlig koncentration av 30 mikrogram / ml), 12,4 mikroliter av UDP-Glukos (för en slutlig koncentration av 80 mikromolära), 31 mikroliter av NEBuffer 4 och upp till 310 mikroliter nukleasfritt vatten att den totala volymen till 310 mikroliter.
- Dela den här reaktionsblandningen i två rör med 155 mikroliter i varje.
- Tillsätt sedan 30 enheter, eller 3 mikroliter av T4-β-glucosyltransferase till ett rör. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned. Det andra röret är kontrollen reaktion, så lägg till 3 mikroliter av vatten, i stället för T4-BGT.
- Inkubera båda rören vid 37 grader i 12 till 18 timmar, under vilken tid T4-BGT kommer att lägga glukos till hydroxylgrupp av 5-hydroxymethylcytosine grupper i provet.
2. Restriktionsenzymanalys Digestion
- Etikett tre 0,2 ml PCR-stav rör siffrorna 1 till 3. Alikvotera 50 ul av reaktionsblandningen i varje.
- Etikett tre 0,2 ml PCR-stav rör nummer 4 till 6. Alikvotera 50 ul av kontrollen blandningen i varje.
- Lägg till 100 enheter, eller 1 mikroliter, av MSPI i rör 1 och 4. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Lägg till 50 enheter, eller 1 mikroliter, av HpaII i rör 2 och 5. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Lägg inte till något till rör 3 och 6, eftersom de är kontroller.
- Inkubera alla 6 rör vid 37 grader Celsius i minst 4 timmar.
- Tillsätt 1 mikroliter av proteinas K i varje rör och inkubera vid 40 grader i 30 minuter.
- Inaktivera proteinas K genom att inkubera vid 95 grader i 10 minuter.
3. Analysera DNA genom PCR / qPCR
Detta protokoll använder NEB är LongAmp Taq för end-point PCR, som har visat sig fungera väl. Andra PCR-protokoll kan ersättas.
- Lägg till följande komponenter till ett 0,2 ml PCR-reaktion röret på is: 10 mikroliter av 5X LongAmp Taq Reaktionsbufferten, 1,5 mikroliter av 10 millimolar dNTPs, 1 mikroliter av 10 mikromolära Forward primer, 1 mikroliter av 10 mikromolära Omvänd Primer, 3 mikroliter av mall DNA från föregående steg, 1 mikroliter av LongAmp Taq DNA-polymeras, och nukleasfritt vatten upp till 50 mikroliter. Dessa volymer kan ändras beroende på PCR-protokoll som används.
- Blanda försiktigt reaktionen. Om det behövs, samla all vätska till botten av röret med en snabb dragning.
- Overlay provet med mineralolja om du använder en termocykler utan ett uppvärmt lock.
- Överför PCR-rör från is till en termocykler med blocket förvärms till 94 grader och börja cykla programmet. För en rutin 3-stegs PCR bör det finnas en initial denaturering steg till 94 grader i 30 sekunder följt av 30 cykler på 94 grader Celsius denaturering i 15 sekunder, från 55 till 65 grader Celsius glödgning i 30 sekunder och 65 grader Celsius förlängning i 20 sekunder eller 50 sekunder per kb. Detta bör följas av en sista förlängning på 65 grader i 5 minuter. Realtids-PCR kan även utföras för att kvantifiera mängder av 5-methylcytosine och 5-hydroxymethylcytosine. Se produktens manual, finns på neb.com för specifik information.
4. Representativa resultat:
Figur 1. Jämförelse av 5-hydroxymethylcytosine belopp vid locus 12 i olika mus BALB / C vävnadsprover. (A), End-point PCR. (B), Real time PCR.
DNA från fyra mus vävnader analyserades. I jämförande syfte, var i realtid PCR uppgifterna normaliseras till uncut DNA. En standardkurva användes för att fastställa Kopiera nummer. Proverna kan normaliseras genom att dividera det antal kopior av prover Nej 1-6 av Antal kopior av den kontroll som osmälta (nr 5). Förpackad gel körfält visar variation i 5-HMC närvarande.
Discussion
Det finns flera viktiga saker att tänka på när du ställer in detta experiment. För det första är det viktigt att glucosylation av arvsmassans DNA intäkterna till färdigställande. Sekvensen specificitet T4-BGT är inte känt, och det verkar ha något val för substrat sekvensen. Därför, i vissa fall kan längre inkubationstiderna bli nödvändig. För det andra MSPI och HpaII matsmältningen måste vara fullständiga för att undvika bakgrund signal. För dessa restriktionsenzymer, rekommenderar vi en inkubationstid på 4 timmar, men längre inkubationer kan utföras när ofullständig klyvning observeras. Det tredje kan mata in DNA belopp justeras beroende på tillgång, eftersom 20 NGS av DNA kan användas för end-point PCR. Slutligen rekommenderar vi att du använder medföljande kontroll DNA som kan köras parallellt med genomiska DNA för 5-MC och 5-HMC kvantifiering.
Disclosures
Både Ted och romer, författare av denna artikel, är anställda i NEB, Romas är den främsta utvecklaren av satsen, med Ted är direktören för Applikationer & Development Department som övervakade utvecklingen av denna sats.
Acknowledgments
Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen laboratorium, UCLA. Detta arbete har delvis stöd av NIH 1R44GM095209-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | |
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | ||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | |
| molecular biology grade water |
References
- Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
- Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
- Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).
