Summary
Beschrijven we een simpele immunoassay om de productie van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1 bèta productie, bij patiënten met autoinflammatory fenotypes te meten. Door het activeren van cellen in volbloed culturen met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, in het bijzonder met lipopolysaccharide, kan cytokine secretie gemakkelijk worden geëvalueerd in volbloed supernatants.
Abstract
Inflammatoire processen als gevolg van de afscheiding van oplosbare mediatoren door immuuncellen, leiden tot verschillende manifestaties in de huid, gewrichten en andere weefsels, alsmede gewijzigde cytokine homeostase. Het aangeboren immuunsysteem speelt een cruciale rol in het herkennen van ziekteverwekkers en andere endogene gevaar stimuli. Een van de belangrijkste cytokines vrijgegeven door aangeboren immuuncellen is Interleukine (IL) -1. Daarom maken we gebruik van een volbloed stimulatie test om de secretie van inflammatoire cytokines te meten en in het bijzonder van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β 1, 2, 3.
Patiënten met genetische disfuncties van het aangeboren immuunsysteem waardoor autoinflammatory syndromen vertonen een overdreven versie van volwassen IL-1β na stimulatie met LPS alleen. Met het oog op het aangeboren immuunsysteem component van de patiënten die zich presenteren met inflammatoire-geassocieerde aandoeningen te evalueren, gebruiken we een specifieke immunoassay om cellulaire immuunresponsen te detecteren pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), zoals de gram-negatieve bacteriële endotoxine, lipopolysaccharide (LPS ). Deze PAMPs worden herkend door pathogeen herkenning receptoren (PRRS), die worden gevonden op de cellen van het aangeboren immuunsysteem 4, 5, 6, 7. Een primaire signaal, LPS, in combinatie met een tweede signaal, ATP, noodzakelijk is voor de activering van de inflammasome, een multiprotein complex dat pro-IL-1β processen om haar rijpe, bioactieve vorm 4, 5, 6, 8, 9, 10.
De volbloed-test vereist slechts een minimale steekproef manipulatie tot cytokine productie te beoordelen in vergelijking met andere methoden die arbeidsintensieve isoleren en kweken van specifieke celpopulaties vereisen. Deze methode onderscheidt zich van andere volbloed stimulatie testen, maar eerder dan verdunnen monsters met een verhouding van RPMI media, voeren we een witte bloedcel direct tellen van verdund volbloed en daarom, het stimuleren van een bekend aantal witte bloedcellen in cultuur 2. De resultaten van deze bijzondere bloed-test aantonen dat er een nieuwe techniek bruikbaar in het ontrafelen van de patiënt cohorten die zich presenteren met autoinflammatory pathophysiologies.
Protocol
1. Het verzamelen van volbloed
- Verkrijgen van een minimum van 10 ml perifeer bloed uit de getroffen zowel individuen als leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles. Veneus bloed moet worden verzameld in natrium Vacutainer bloedafnamebuisjes, in plaats van het gebruik van andere anticoagulantia zoals EDTA, en omgekeerd een paar keer een goede mengsel met de natrium-heparine te verzekeren. Merk op dat 10 ml is het minimale volume van de volbloed die nodig zijn voor plating monsters in duplo voor deze test.
- De monsters moeten zo snel mogelijk verwerkt worden na inzameling voor de beste resultaten. Echter, gehepariniseerd bloed worden bewaard bij kamertemperatuur onder dim verlichting voor maximaal 24 uur tot klaar om te worden verwerkt (2).
2. Voorbereiding van de volbloed
- Centrifuge alle bloedmonsters bij 3000 toeren per minuut (met rem uitgeschakeld) gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Zonder de buffy coat, kan het plasma worden afgehaald bij de top en opgeslagen voor andere experimentele doeleinden. Plasma monsters kunnen tijdelijk worden opgeslagen bij -20 ° C of -80 ° C voor lange termijn opslag
- Zodra plasma wordt verzameld, gewassen monsters door resuspenderen de rode bloedcellen (RBC) pellet en buffy coat met serum vrij (onvolledige) RPMI 1640 media (bij omgevingstemperatuur). Voorzichtig pipet het mengsel in de collectie buizen en over te dragen aan een 50 ml conische buis.
- Volume tot 50 ml met onvolledige RPMI 1640 media cultuur en voorzichtig de buizen om een homogeen mengsel te creëren omkeren. Centrifugeer monsters bij 3000 toeren per minuut (met rem uitgeschakeld) gedurende tien minuten. Ervoor zorgen dat er een duidelijke scheiding, zuig het supernatant, zorg dat u de buffy coat verstoren. Herhaal deze procedure 2-4 keer om ervoor te zorgen dat alle verontreinigingen en gebonden cytokines voorafgaand worden verwijderd om de stimulatie.
- Na de laatste wasbeurt, zodat resuspendeer de RBC pellet en buffycoat dat het totale volume is 20 ml (voor 10 ml van volbloed in eerste instantie getrokken) met onvolledige RPMI 1640 media. Het totale volume kan worden aangepast op basis van het volume van het bloed in eerste instantie getrokken.
- Met behulp van de Cellometer Vision, kan verdund bloed worden geteld zonder lyseren RBC's door te kiezen voor de witte bloedcellen optie met acridine oranje (AO). Voeg een deel verdund bloed met een deel AO en de belasting 20 pi van de 1:1 mengsel in een wegwerp-telkamer. De uiteindelijke concentratie van AO na verdunning moet worden 1μg/mL.
- Dienovereenkomstig aan te passen met onvolledige RPMI 1640 media tot een uiteindelijke concentratie cel van 2,0 x 10 6 cellen / ml.
3. Stimulatie van volbloed
- De test vereist een minimum van vier voorwaarden (elke opgemaakt in tweevoud): ongestimuleerde, toevoeging van LPS alleen, toevoeging van ATP alleen, en tot slot LPS plus ATP bij elkaar opgeteld. Voeg 1 ml van de bereide 2,0 x 10 6 cellen / ml verdund volbloed in de juiste putje van een 24-well weefselkweek plaat.
- De stimulerende middelen moet worden opgelost en getogen op kamertemperatuur voor het begin van de stimulatie test. Gevriesdroogde LPS en ATP moet worden gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant. Na reconstitutie, kan LPS en ATP verder worden verdund om een goede voorraad concentratie met behulp van onvolledige RPMI 1640 media.
- Voeg LPS aan de LPS alleen als de LPS plus ATP goed zodat de uiteindelijke werking concentratie van LPS is 1 ug / ml. De totale stimulatie tijd is 3 uur. Echter, is volbloed gestimuleerd met LPS gedurende 2 uur en 40 minuten. Monsters moeten worden geplaatst in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- ATP is toegevoegd gedurende de resterende 20 minuten van de 3 uur stimulatie periode. Voeg ATP aan de ATP alleen en de LPS en ATP goed en plaats monsters in incubator. De uiteindelijke werking concentratie van ATP is 2 mm.
- Na de drie uur incubatietijd, het verzamelen van supernatantia door aliquoting elk monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vervolgens gecentrifugeerd monsters op 10000 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenstaande vloeistoffen naar een andere set van 1,5 microcentrifuge buizen.
- Monsters kunnen direct worden getest of tijdelijk opgeslagen bij -20 ° C of -80 ° C voor opslag op lange termijn.
4. Cytokine Assay
- Monsters die worden bevroren moeten op kamertemperatuur evenwicht voor de analyse. Cytokine concentraties voor IL-1βcan worden beoordeeld met behulp van verschillende methoden. We maken gebruik van de Bio-plex Pro menselijk cytokine x-plex test met de Bio-Plex 200 systeem, volgens de instructies van de fabrikant. In dit protocol zijn wij specifiek op het meten van IL-1β, maar we gebruiken deze multiplex cytokine test om gelijktijdig meerdere cytokinen te meten in een test met het voordeel van het gebruik van een kleine steekproef volume.
5. Representatieve resultaten
Analyse van de IL-1β de productie op een succesvolle stimulatie met LPS en ATP toont een doe-se antwoord afhankelijk van het aantal cellen wordt gestimuleerd. We hebben ontdekt dat 2,0 x 10 6 cellen / ml is een voldoende concentratie om een optimale en meetbare concentratie van IL-1β evenals andere cytokines (figuur 2) te produceren.
Volbloed assays zijn nuttig bij het bestuderen van patiënten die aanwezig zijn met autoinflammatory manifestaties. Deze patiënten kunnen vertonen een defect in het aangeboren immuunsysteem, dat kan worden gekenmerkt door overproductie van IL-1β (in vergelijking met controles) na stimulatie met LPS alleen (figuur 3).
Figuur 1. Representatief beeld van de AO kleuring voor kernhoudende witte bloedcellen wordt gebruikt om de cel concentratie te bepalen in verdunde volbloedmonsters.
Figuur 2. IL-1β gemeten productie in volbloed supernatanten van een gezonde donor na stimulatie met LPS op het vergroten van cel-concentraties. Monsters werden getest in drievoud.
Figuur 3. Representatieve resultaten van IL-1β secretie gemeten in volbloed supernatanten van twee gezonde normale controles en twee patiënten met IL-1β-geassocieerde autoinflammatory manifestaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gehele beschreven bloed-test is een eenvoudige methode die beter nabootst fysiologische omstandigheden in vergelijking met andere technieken die celisolatie en uitgebreide steekproef verwerking en manipulatie zou vereisen. Deze methode maakt gebruik van de Cellometer Vision met AO te witte bloedcellen tellen in volbloed en daarom biedt een manier om nauwkeurig te standaardiseren op basis van samples cel aantallen.
Er dient te worden opgemerkt dat voor deze test, vol bloed moet worden getrokken in natriumheparine collectie buizen als andere anticoagulantia zijn bekend calciumvangers en kunnen dus invloed op de resultaten van de test. Serum-vrije media moeten ook worden gebruikt, omdat dit van invloed kunnen zijn cytokine concentraties. Ook van cruciaal belang is de onmiddellijke verwerking van de monsters een keer verkregen. Terwijl beschreven methode maakt gebruik van LPS en ATP te stimuleren volbloed en maatregelen IL-1βconcentration, andere ziekteverwekkers en stimuli kunnen worden gebruikt om verschillende cytokine en chemokine reacties na stimulatie te meten, maar kan stimuleren en de omstandigheden moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Ten slotte kan een constante vries-dooi cycli beïnvloeden cytokine concentraties.
De detectie van IL-1β inzet van het gehele bloed beschreven stimulatie test biedt een alternatief voor andere methoden en is een effectieve immunoassay voor ziekten met een inflammatoire-geassocieerde pathologieën te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
