Summary
우리는 autoinflammatory phenotypes와 함께 제시 환자에있어서 IL - 1 베타의 생산과 같은 프로 염증성 크린 시토킨의 생산, 측정하는 간단한 면역 분석법을 설명합니다. 특히 lipopolysaccharide와 병원체 - 관련된 분자 패턴과 전체 혈액 배양에서 세포를 활성화하여, 시토킨 분비가 편리 전체 혈액 supernatants에서 평가하실 수 있습니다.
Abstract
면역 세포에 의해 용해 중재자의 분비로 인한 염증성 과정, 피부, 관절과 기타 조직뿐만 아니라 변경 시토킨 항상성의 다양한 발현로 이어집니다. 타고난 면역 체계는 병원균과 다른 내생 위험 자극의 인식에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 타고난 면역 세포에 의해 발표 주요 크린 시토킨 중 하나는 인터루킨 (IL) -1입니다. 따라서, 우리는 염증 크린 시토킨의 분비를 측정하기 위해, 특히 프로 염증 시토킨 IL - 1β 1, 2, 3의 전체 혈액 자극 분석을 활용한다.
autoinflammatory syndromes를 일으키는 본래 면역 시스템의 유전자 장애 환자는 혼자 LPS로 자극시 IL - 1β 성숙의 과장 릴리스를 보여줍니다. 염증 - 관련 pathologies로 현재 환자의 타고난 면역 구성 요소를 평가하기 위해, 우리는 그람 음성 세균의 내독소 같은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)에 세포 면역 반응을 감지하는 특정 면역 분석법, lipopolysaccharide (LPS를 사용하여 ). 이러한 PAMPs은 본래 면역 체계 4, 5, 6, 7의 세포에서 찾을 수있는 병원체 인식 수용체 (PRRs)에 의해 인정됩니다. 보조 신호, ATP, inflammasome의 활성화, 그 성숙, bioactive 형태 4, 5, 6, 8, 9 프로 IL - 1β 처리하는 multiprotein 복합 필요한 함께 기본 신호, LPS, 10.
전체 혈액 분석은 특정 세포 집단의 노동 집약적인 고립과 culturing을 필요로 다른 방법에 비해 시토킨 생산을 평가하기 위해 최소한의 샘플 조작이 필요합니다. 이 방법은 다른 모든 혈액 자극의 assays 다릅니다; 오히려 RPMI 미디어의 비율로 샘플을 diluting보다, 우리는 백혈구가 희석 전체 혈액에서 직접 계산되므로, 문화 2 백혈구의 알려진 숫자를 자극 수행합니다. 이 특정 전체 혈액 분석의 결과는 autoinflammatory pathophysiologies와 함께 제시 환자의 동료를 elucidating에 도움이 소설 기법을 보여줍니다.
Protocol
1. 전체 혈액 수집
- 영향을받는 개인뿐만 아니라 나이, 성별 일치하는 건강한 컨트롤에서 말초혈 10 ML 최소를 얻습니다. 정맥 혈액이 아니라 나트륨 헤파린과 적절한 혼합을 보장하기 위해 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 거꾸로 여러 번 같은 다른 anticoagulants를 사용하여보다 나트륨 헤파린의 vacutainer 혈액 수집 튜브에 수집한다. 10 ML이 특정 검정에 대한 중복의 도금 샘플에 필요한 전체 혈액의 최소 볼륨입니다.
- 샘플은 최상의 결과를 위해 수집 후 가능한 빨리 처리되어야합니다. 최대 24 시간 (2) 처리 될 준비까지를 위해 그러나, heparinized 혈액이 희미한 조명 아래의 상온에서 저장할 수 있습니다.
2. 전체 혈액의 준비
- 상온 10 분 3,000 RPM (브레이크가 해제된 상태로)에서 모든 혈액 샘플을 원심 분리기. 버피 코트를 방해하지 않고, 플라즈마는 위로부터 수집된 수 있으며, 다른 실험 목적을 위해 저장됩니다. 플라즈마 샘플은 일시적 ° C 장기 저장을 위해 -20 ° C 또는 -80에 저장할 수 있습니다
- 일단 플라즈마를 수집, 혈청 무료 (불완전) RPMI 1640 미디어 (주위 온도에서)와 적혈구 세포 (RBC) 펠렛과 버피 코트를 resuspending하여 샘플을 씻으십시오. 부드럽게 모음 튜브의 혼합물을 피펫과 50 ML 원뿔 관을 전송할 수 있습니다.
- 최대 불완전한 RPMI 1640 문화 미디어 50 ML하고 부드럽게 동질적인 혼합을 만들 수있는 튜브를 반전 볼륨. 십분 3,000 RPM (브레이크가 해제된 상태로)에서 샘플을 원심 분리기. 확인하는 것은 명확한 분리가, 버피 코트를 방해하지 않도록주의하고, 표면에 뜨는를 대기음. 이 절차 모든 오염 물질과 바운드 크린 시토킨가 자극하기 전에 제거되는 것을 보장하기 위해 2-4 번 반복합니다.
- 마지막 세척 후, 전체 볼륨이 불완전 RPMI 1640 미디어 20 ML (처음 그려 전체 혈액의 10 ML)을되도록 RBC 펠렛과 버피 코트를 resuspend. 전체 볼륨이 처음 그려진 혈액의 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다.
- Cellometer 비전을 사용하여 희석 혈액 acridine 오렌지 (AO)를 사용하여 백혈구의 숫자 옵션을 선택하여 lysing RBCs없이 계산하실 수 있습니다. 한 부분의 AO와 부하 일회용 계산 챔버에 1시 1분 혼합물 20 μL 한 부분 희석 혈액을 추가합니다. 희석 후 AO의 최종 농도는 1μg/mL해야합니다.
- 2.0 X 10 6 세포 / ML의 최종 세포 농도 불완전한 RPMI 1640 미디어 따라 조정합니다.
3. 전체 혈액의 자극
- 검정 네 조건 (각 중복 이루어)의 최소 필요합니다 unstimulated 혼자 LPS의 추가, ATP 혼자의 추가, 그리고 마지막으로 LPS 플러스 ATP가 함께 추가되었습니다. 24 잘 조직 문화 판의 해당 잘으로 준비 2.0 X 10 6 세포 / ML 희석 전체 혈액의 1 ML을 추가합니다.
- 자극은 자극 분석을 시작하기 전에 재구성하고 실온까지 가지고 있어야합니다. 동결 건조된 LPS와 ATP는 제조 업체의 지시에 따라 재구성되어야합니다. reconstitution 후, LPS와 ATP가 더욱 불완전 RPMI 1640 미디어를 사용하여 적절한 재고 농도 희석 수 있습니다.
- 물론 이렇게 LPS의 마지막 작업 농도가 1 μg / ML되는 LPS에만뿐만 아니라 LPS 플러스 ATP에 LPS를 추가합니다. 전체 자극 시간은 3 시간입니다. 그러나, 전체 혈액이 2 시간 40 분 LPS로 자극합니다. 샘플은 37 ° C와 5% CO 2 배양기에 배치해야합니다.
- ATP는 3 시간 자극 기간의 나머지 이십분 동안 추가됩니다. ATP 혼자와 LPS와 인큐베이터에서 ATP의 잘과 장소 샘플로 ATP를 추가합니다. ATP의 마지막 작업 농도 2mM입니다.
- 3 시간 잠복기 후, 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각각의 샘플을 aliquoting 및 이후 상온에서 2 분 동안 10,000 rpm으로 샘플을 centrifuging하여 supernatants를 수집합니다. 1.5 microcentrifuge 튜브 다른 설정 supernatants를 전송합니다.
- 샘플은 즉시 ° C 장기 저장을 위해 -20 ° C 또는 -80에서 일시적으로 assayed하거나 저장할 수 있습니다.
4. 시토킨 분석
- 냉동 샘플 분석하기 전에 실내 온도 평형해야합니다. IL - 1βcan에 대한 시토킨 농도는 다양한 방법을 사용하여 평가됩니다. 우리는 제조 업체의 지침에 따라, 바이오 플렉스 200 시스템과 함께 X - 플렉스 분석 바이오 플렉스 프로 인간 시토킨을 활용한다. 이 프로토콜에서는 IL - 1β 구체적으로 측정되지만, 우리는 동시에 작은 샘플 볼륨을 사용하는 혜택 한 분석에서 여러 크린 시토킨을 측정하기 위해이 멀티 플렉스 시토킨 분석을 활용한다.
5. 대표 결과
LPS와 ATP와 함께 성공적인 자극시 IL - 1β 생산 분석 할 보여줍니다SE 자극되는 세포의 숫자에 따라 반응. 우리는 2.0 X 10 6 세포 / ML은 IL - 1β의 최적 및 측정 농도뿐만 아니라 다른 크린 시토킨 (그림 2)를 생산하기 위해 충분한 농도 것으로 나타났습니다.
전체 혈액 assays는 autoinflammatory 발현과 현재 환자를 공부에 유용합니다. 이러한 환자는 혼자 LPS (그림 3)과 자극시 IL - 1β의 생산 과잉 (컨트롤에 비해)을 특징으로 할 수있는 타고난 면역 체계에 결함이 표시될 수 있습니다.
그림 1. 희석 전체의 혈액 샘플에서 세포 농도를 결정하기 위해 사용되는 nucleated 백혈구에 대한 AO의 얼룩 대표 이미지.
그림 2. IL - 1β 생산 증가 세포 농도에서 LPS로 자극시 건강한 기증자로부터 온 혈액 supernatants로 측정. 샘플은 세중의에 assayed되었습니다.
그림 3. 두명의 건강한 정상 컨트롤뿐만 아니라 IL - 1β - 관련 autoinflammatory 발현과 표현이 환자에서 전체 혈액 supernatants에서 측정한 IL - 1β 분비 대표 결과입니다.
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Discussion
설명 전체 혈액 분석은 세포 분리 및 광범위한 시료 처리 및 조작을 필요로 다른 기술에 비해보다 밀접하게 생리 조건을 모방하는 간단한 방법입니다. 이 방법은 전체 혈액의 백혈구를 계산하기 때문에, 정확하게 셀 번호에 따라 샘플을 표준화하는 방법을 제공하기 위해 AO와 Cellometer 비전을 활용합니다.
그것은이 분석을 위해, 전체 혈액은 다른 anticoagulants가 칼슘 chelators을 알고 있으므로 헤파린 나트륨 수집 튜브로 그려해야하기 때문에 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있다고 언급되어야한다. 이 시토킨 농도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 혈청 무료 미디어도 사용해야합니다. 또한 중요한 한 번 얻은 샘플의 즉각적인 처리됩니다. 설명한 방법은 전체 혈액을 자극하는 LPS와 ATP를 사용하여 IL - 1βconcentration, 다른 병원균과 자극이 자극에 따라 다양한 시토킨 및 케모카인 응답을 측정하는 데 사용할 수를 측정하는 반면 있지만, 자극 시간과 조건 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 마지막으로, 일정한 동결 - 해동주기는 시토킨 농도에 영향을 미칠 수 있습니다.
설명 전체 혈액 자극 분석을 이용하여 IL - 1β의 감지는 다른 방법에 대한 대안을 제공하고 염증 - 관련 pathologies과 질병을 연구하는 효과적인 면역 분석법이다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 관절염과 미 국립 보건원의 Musculoskeletal와 피부 질환의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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