Summary
Мы опишем простой иммуноанализа для измерения производство провоспалительных цитокинов, таких как IL-1 бета производства, у пациентов с autoinflammatory фенотипы. При активации клеток в целом посевы крови с возбудителем связанные молекулярные модели, в частности, с липополисахарид, секрецию цитокинов может быть удобно оценивать в целом супернатанты крови.
Abstract
Воспалительные процессы в результате секреции растворимых медиаторов иммунных клеток, приводят к различным проявлениям в коже, суставах и других тканях, а также нарушении гомеостаза цитокинов. Врожденная иммунная система играет ключевую роль в распознавании патогенов и других эндогенных раздражителей опасности. Одним из основных цитокинов выпущен врожденного иммунитета клеток интерлейкина (IL) -1. Таким образом, мы используем весь анализ стимуляции крови, чтобы измерить секрецию воспалительных цитокинов и, в частности из провоспалительных цитокинов IL-1β 1, 2, 3.
Пациенты с генетическими дисфункции иммунной системы вызывает autoinflammatory синдромов показать преувеличенные выпуск зрелого ИЛ-1β при стимуляции ЛПС в одиночку. Для того чтобы оценить врожденный иммунный компонент пациентов с воспалительными связанных патологий, мы используем специальный иммунологический анализ для выявления клеточный иммунный ответ на патоген-связанные молекулярные модели (PAMPs), таких как грамотрицательные бактериальные эндотоксины, липополисахариды (ЛПС ). Эти PAMPs признаны возбудителя рецепторы распознавания (РРСС), которые находятся на клетки иммунной системы 4, 5, 6, 7. Первичного сигнала, ЛПС, в сочетании с вторичным сигнал, АТФ, необходимой для активации inflammasome, multiprotein комплекса, процессы про-IL-1β в своей зрелой, биологически активные формы 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Весь анализ крови требует минимальных манипуляций образец для оценки продукции цитокинов по сравнению с другими методами, которые требуют трудоемких изоляции и культивирования конкретных клеточных популяций. Этот метод отличается от других все анализы крови стимуляции, а, скорее, чем разбавления образцов с отношением RPMI средства массовой информации, мы выполняем белых клеток крови непосредственно из разбавленных цельной крови и, следовательно, стимулируют известно количество белых кровяных клеток в культуре 2. Результаты данного анализа крови целом продемонстрировать новый метод полезным для выяснения пациента когорты представления с autoinflammatory pathophysiologies.
Protocol
1. Сборник цельной крови
- Получить не менее 10 мл периферической крови пострадавших лиц, а также возраста и пола соответствует здоровой контрольной группой. Венозная кровь должна быть собрана в гепарин натрия Vacutainer трубы для забора крови, а не использовать другие антикоагулянты, такие как ЭДТА, и перевернутый несколько раз, чтобы обеспечить надлежащее смеси с гепарином натрия. Обратите внимание, что 10 мл минимальный объем цельной крови, необходимых для покрытия образцы в двух экземплярах для данного анализа.
- Образцы должны быть обработаны как можно скорее после сбора для лучших результатов. Тем не менее, гепаринизированной крови можно хранить при комнатной температуре при тусклом освещении в течение 24 часов, пока не готового к исполнению (2).
2. Подготовка цельной крови
- Центрифуга все образцы крови при 3000 оборотов в минуту (с тормозным выключен) в течение десяти минут при комнатной температуре. Не нарушая пальто Баффи, плазма может быть собран из верхней и хранить для других экспериментальных целях. Образцы плазмы можно временно хранить при температуре -20 ° С или -80 ° С для длительного хранения
- Как только плазма собирается, мыть образцов ресуспендирования эритроцитов (RBC) гранул и лейкомассы с бессывороточной (неполный) RPMI 1640 средств массовой информации (при температуре окружающей среды). Аккуратно пипетки смеси в коллекции трубок и трансфер в 50 мл коническую трубку.
- Объем до 50 мл с неполной RPMI 1640 медиакультуры и аккуратно переверните труб для создания однородной смеси. Центрифуга образцов при 3000 оборотов в минуту (с тормозным выключен) в течение десяти минут. Убедившись, есть четкое разделение, аспирация супернатант, стараясь не нарушить слой кровяного сгустка. Повторите эту процедуру 2-4 раза, чтобы убедиться, что все загрязнения и связанных цитокинов удаляются до стимуляции.
- После последней стирки, ресуспендируют РБК гранул и лейкомассы так, чтобы общий объем составляет 20 мл (на 10 мл цельной крови сначала рисуются) с неполной RPMI 1640 средств массовой информации. Общий объем может быть скорректирована исходя из объема крови первоначально нарисован.
- Использование Cellometer Vision, разбавленной крови можно пересчитать без лизиса эритроцитов, выбрав белых кровяных клеток опцию с помощью акридинового оранжевого (АО). Добавьте одну часть разведенной крови с одной стороны и АО нагрузка 20 мкл смеси 1:1 в одноразовой камеры подсчета. Конечная концентрация АО после разведения должны быть 1μg/mL.
- Отрегулируйте соответственно с неполной RPMI 1640 СМИ, чтобы конечная концентрация ячейки 2,0 х 10 6 клеток / мл.
3. Стимуляция цельной крови
- Анализ требует минимум четырех условий (каждый сделал в двух экземплярах): нестимулированных, добавление ЛПС один, добавление АТФ в одиночку, и, наконец, LPS плюс АТФ суммируются. Добавить 1 мл подготовленной 2,0 х 10 6 клеток / мл разбавленного цельной крови в соответствующую лунку 24-луночного планшета для культуры ткани.
- Стимуляторов должна быть восстановлена и доведена до комнатной температуры перед началом стимуляции анализа. Лиофилизированный LPS и АТФ должна быть восстановлена в соответствии с инструкциями производителя. После восстановления, LPS и АТФ может быть дополнительно разводят до соответствующей концентрации ценных бумаг при использовании неполной RPMI 1640 средств массовой информации.
- Добавить ЛПС, LPS только, а также ЛПС плюс АТФ и таким образом, чтобы окончательный рабочий концентрации ЛПС составляет 1 мкг / мл. Общее время стимуляции составляет 3 часа. Однако цельной крови стимулируется с ЛПС в течение 2 часов и 40 минут. Образцы должны быть помещены в термостат при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- АТФ добавлены в течение оставшихся 20 минут 3 периода стимуляции часов. Добавить АТФ АТФ в одиночку и ЛПС и АТФ также и место образцы в инкубатор. Окончательный рабочей концентрации АТФ 2 мм.
- После инкубационного периода 3 часа, собирают супернатанты по aliquoting каждого образца в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугирования образцов при 10000 оборотов в минуту в течение 2 минут при комнатной температуре. Передача супернатантах с другим набором пробирки на 1,5 микроцентрифужных.
- Образцы могут быть проанализированы немедленно или временно храниться при температуре -20 ° С или -80 ° С в течение длительного хранения.
4. Цитокинов Пробирной
- Образцы, которые заморожены необходимо, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед анализом. Цитокинов концентраций ИЛ-1βcan оцениваться с помощью различных методов. Мы используем Bio-Plex Pro человеческого цитокина х-Plex анализа с Bio-Plex 200 системы, в соответствии с инструкциями производителя. В этом протоколе мы специально измерения ИЛ-1β, однако, мы используем этот анализ мультиплекс цитокин для того, чтобы одновременно измерять различные цитокины в одном анализе с преимуществом использования малого объема выборки.
5. Представитель Результаты
Анализ ИЛ-1β производства после успешного стимуляции LPS и АТФ показывает, делатьсебе ответ зависит от количества клеток стимулируется. Мы обнаружили, что 2,0 х 10 6 клеток / мл, концентрации, достаточной для получения оптимального и измеримые концентрации ИЛ-1β, а также других цитокинов (рис. 2).
Всего анализы крови, полезны при изучении пациентов, которые представляют с autoinflammatory проявлениях. Эти пациенты могут показать дефект иммунной системы, которая может быть охарактеризована перепроизводство ИЛ-1β (по сравнению с контрольной группой) при стимуляции ЛПС в одиночку (рис. 3).
Рисунок 1. Представителю образ АО окрашивание на ядерные лейкоциты, используемых в целях определения концентрации клеток в разбавленных образцах цельной крови.
Рисунок 2. ИЛ-1β производства измеряется в целом супернатанты крови здорового донора при стимуляции ЛПС на повышение концентрации клеток. Образцы были проанализированы в трех экземплярах.
Рисунок 3. Представителю результаты ИЛ-1β секреции измеряется в целом супернатанты крови от двух здоровых нормальных управления, а также двух пациентов с IL-1β связанных autoinflammatory проявлениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Весь анализ крови описанная простой метод, который более точно имитирует физиологические условия по сравнению с другими методами, которые требуют изоляторе и обширные обработки образца и манипуляции. Этот метод использует Cellometer Видение с АО для подсчета белых кровяных клеток в цельной крови и, следовательно, дает возможность точно стандартизации образцов на основе числа клеток.
Следует отметить, что для этого теста, цельной крови должны быть вовлечены в трубах гепарин натрия коллекции как и другие антикоагулянты, как известно кальция энтеросорбенты и могут таким образом повлиять на результаты анализа. Сыворотка свободные средства массовой информации также должны быть использованы, поскольку это может повлиять на цитокинов концентрациях. Также важным является немедленной обработки образцов когда-то получили. В то время как метод, описанный использует LPS и АТФ, чтобы стимулировать цельной крови и меры Ил-1βconcentration, других патогенных микроорганизмов и стимулы могут быть использованы для измерения различных цитокинов и хемокинов ответов при стимуляции, однако, стимулирование времени и условий, возможно, потребуется внести соответствующие коррективы. Наконец, постоянное циклов замораживания-оттаивания может повлиять цитокинов концентрациях.
Обнаружение ИЛ-1β использованием целом анализ крови стимуляции описано является альтернативой другим методам и является эффективным иммуноанализа для изучения болезней с воспалительным связанных патологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Внутренние программы исследований Национального института артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний Национального института здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
