Summary
Se describe un inmunoensayo simple para medir la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1 beta, en pacientes con fenotipos autoinflamatoria. Mediante la activación de las células en cultivos de sangre total con el patógeno patrones moleculares asociados, específicamente con lipopolisacárido, la secreción de citoquinas puede ser convenientemente evaluada en los sobrenadantes de sangre total.
Abstract
Los procesos inflamatorios como resultado de la secreción de mediadores solubles de las células inmunes, conducen a diversas manifestaciones en la piel, articulaciones y otros tejidos, así como la homeostasis alterada de citoquinas. El sistema inmune innato desempeña un papel crucial en el reconocimiento de patógenos y otros estímulos endógenos peligro. Una de las principales citoquinas liberadas por células del sistema inmune innato es interleuquina (IL) -1. Por lo tanto, utilizamos un análisis de sangre toda la estimulación con el fin de medir la secreción de citoquinas inflamatorias y, específicamente, de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β 1, 2, 3.
Los pacientes con trastornos genéticos del sistema inmune innato que causan síndromes de autoinflamatoria muestran una versión exagerada de IL-1β madura a la estimulación con LPS solo. Con el fin de evaluar el componente inmune innato de los pacientes que presentan patologías inflamatorias asociadas, se utiliza un inmunoensayo específico para detectar la respuesta inmune celular a patógenos patrones moleculares asociados (PAMP), tales como las endotoxinas bacterianas gram-negativas, el lipopolisacárido (LPS ). Estos PAMPs son reconocidos por receptores de reconocimiento de patógenos (RRP), que se encuentran en las células del sistema inmune innato 4, 5, 6, 7. Una señal de primaria, LPS, junto con una señal secundaria, ATP, es necesaria para la activación de la inflamasoma, un complejo multiproteico que los procesos de pro-IL-1β a su forma madura, bioactivos 4, 5, 6, 8, 9, 10.
La prueba de sangre entera requiere una manipulación mínima de la muestra para evaluar la producción de citoquinas en comparación con otros métodos que requieren mucha mano de obra de aislamiento y cultivo de poblaciones celulares específicas. Este método se diferencia de otras pruebas de sangre entera estimulación, en lugar de diluir las muestras con una proporción de RPMI medios de comunicación, se realiza un recuento de glóbulos blancos directamente de la sangre entera diluida y, por tanto, estimular un número conocido de células blancas de la sangre en la cultura 2. Los resultados de este ensayo en sangre entera en particular demostrar una nueva técnica útil en el esclarecimiento de cohortes de pacientes que presentan fisiopatologías autoinflamatoria.
Protocol
1. Recolección de sangre entera
- Obtener un mínimo de 10 ml de sangre periférica de los individuos afectados, así como la edad y el sexo controles sanos. La sangre venosa se deberían recoger en tubos vacutainer con heparina sódica de recolección de sangre, en lugar de utilizar otros anticoagulantes como EDTA, y se invierte varias veces para asegurar una mezcla adecuada con la heparina sódica. Tenga en cuenta que 10 ml es el volumen mínimo de sangre requerido para la siembra en las muestras por duplicado para este ensayo en particular.
- Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resultados. Sin embargo, la sangre heparinizada se pueden almacenar a temperatura ambiente bajo condiciones de poca iluminación para un máximo de 24 horas hasta que esté listo para ser procesado (2).
2. Preparación de sangre entera
- Centrifugar todas las muestras de sangre a 3.000 rpm (con freno desactivado) durante diez minutos a temperatura ambiente. Sin alterar la capa leucocitaria, el plasma se pueden obtener de la parte superior y se almacena para otros fines experimentales. Las muestras de plasma se puede almacenar temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo
- Una vez que el plasma se recoge, lavado de las muestras por resuspensión de los glóbulos rojos (GR) de pellets y la capa leucocitaria con suero libre (incompleta) RPMI 1640 los medios de comunicación (a temperatura ambiente). Pipeta suavemente la mezcla en los tubos de recogida y traslado a un tubo cónico de 50 ml.
- Volumen hasta 50 ml con los medios de comunicación incompleta de cultivo RPMI 1640 y suavemente invierta los tubos para crear una mezcla homogénea. Centrifugar las muestras a 3000 rpm (con freno desactivado) durante diez minutos. Asegurarse de que exista una separación clara, aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar la capa leucocitaria. Repita este procedimiento 2-4 veces para asegurarse de que todos los contaminantes y las citocinas obligado se retiran antes de la estimulación.
- Después del último lavado, resuspender el precipitado de glóbulos rojos y la capa leucocitaria de modo que el volumen total es de 20 ml (para 10 ml de sangre total extraída inicialmente) con incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación. El volumen total se puede ajustar en función del volumen de sangre extraída inicialmente.
- Uso de la Visión Cellometer, sangre diluida se puede contar sin glóbulos rojos lisis por la elección de la opción de glóbulos blancos cuentan con naranja de acridina (AO). Añadir una parte de la sangre diluida con AO una parte, y carga de 20 l de la mezcla de 1:1 en una cámara de recuento desechables. La concentración final de AO después de la dilución debe ser 1μg/mL.
- Los ajustes necesarios con incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación a una concentración celular final de 2.0 x 10 6 células / ml.
3. La estimulación de la sangre entera
- El ensayo requiere un mínimo de cuatro condiciones (cada uno hizo por duplicado): estimular, además de LPS solo, la adición de ATP sola, y finalmente LPS más ATP se suman. Añadir 1 ml del preparado 2.0 x 10 6 células / ml de sangre total diluida en el pozo apropiado de una placa de tejido de 24 pocillos.
- Los estimulantes debe ser reconstituido y que alcance la temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo de estimulación. Liofilizado LPS y el ATP debe ser reconstituido de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Tras la reconstitución, LPS y el ATP puede ser diluida a una concentración de existencias adecuada utilizando incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación.
- Añadir a la LPS LPS sólo, así como a la LPS más ATP y por lo que la concentración final de trabajo de LPS es 1 mg / ml. La duración de la estimulación total es de 3 horas. Sin embargo, la sangre es estimuladas con LPS durante 2 horas y 40 minutos. Las muestras se colocarán en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2.
- ATP se agrega durante los restantes 20 minutos del período de estimulación 3 horas. Añadir a la ATP ATP y solo el LPS y así ATP y las muestras de lugar en la incubadora. La concentración final de trabajo de ATP es de 2 mm.
- Después del período de incubación de 3 horas, recoger los sobrenadantes por alícuotas de cada muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y posteriormente centrifugar las muestras a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a otro conjunto de tubos de 1,5 microcentrífuga.
- Las muestras pueden analizarse inmediatamente o almacenada temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. Citoquinas ensayo
- Las muestras que se congelan necesidad de equilibrar a temperatura ambiente antes del análisis. Las concentraciones de citocinas para IL-1βcan se evaluó a través de una variedad de métodos. Utilizamos el Bio-Plex citoquina pro humanos x compleja ensayo con el Bio-Plex 200 del sistema, las instrucciones del fabricante. En este protocolo están específicamente la medición de IL-1β, sin embargo, nosotros utilizamos este ensayo multiplex de citoquinas con el fin de medir simultáneamente múltiples citocinas en un ensayo con la ventaja de utilizar un pequeño volumen de muestra.
5. Resultados representante
El análisis de la IL-1β de producción a la estimulación con LPS éxito y el ATP se muestra unasí la respuesta depende del número de células se estimularon. Hemos encontrado que x 2.0 10 6 células / ml es una concentración suficiente para producir una concentración óptima y medibles de IL-1β, así como otras citoquinas (Figura 2).
Los ensayos de toda la sangre son útiles en el estudio de los pacientes que presentan manifestaciones autoinflamatoria. Estos pacientes pueden presentar un defecto en el sistema inmune innato, que se caracteriza por la sobreproducción de IL-1β (en comparación con los controles) a la estimulación con LPS solo (Figura 3).
Figura 1. Imagen representativa de la tinción de AO de células nucleadas blancas de la sangre utilizada para determinar la concentración de células en muestras de sangre diluida.
Figura 2. IL-1β producción medida en el sobrenadante de sangre de un donante sano a la estimulación con LPS en las concentraciones de células cada vez mayor. Las muestras fueron analizadas por triplicado.
Figura 3. Los resultados representativos de la secreción de IL-1β medidos en los sobrenadantes de sangre total de dos controles normal y saludable, así como dos pacientes con IL-1β, de manifestaciones de autoinflamatoria.
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Discussion
La prueba de sangre entera se describe un método simple que reproduce mejor las condiciones fisiológicas en comparación con otras técnicas que requieren aislamiento de células y procesamiento de muestras extensas y la manipulación. Este método utiliza la visión Cellometer con AO para contar los glóbulos blancos en la sangre y por lo tanto, proporciona una manera de estandarizar la precisión muestras basadas en el número de células.
Hay que tener en cuenta que para este ensayo, la sangre entera debe ser elaborado en los tubos de recogida de sodio como anticoagulante heparina se conocen otros quelantes de calcio y por lo tanto puede afectar a los resultados de la prueba. Medio libre de suero también se debe utilizar, ya que puede afectar a las concentraciones de citocinas. También importante es la transformación inmediata de las muestras una vez obtenida. Mientras que el método descrito utiliza LPS y ATP para estimular la sangre y las medidas 1βconcentration IL-, otros agentes patógenos y los estímulos pueden ser utilizados para medir diferentes citocinas y quimiocinas respuestas a la estimulación, sin embargo, los tiempos de la estimulación y las condiciones puede ser necesario ajustar en consecuencia. Por último, constantes ciclos de congelación y descongelación puede afectar las concentraciones de citoquinas.
La detección de IL-1β utilizando el análisis de sangre toda la estimulación descrito proporciona una alternativa a otros métodos, y es un inmunoensayo eficaz para estudiar las enfermedades inflamatorias con patologías asociadas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la piel de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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