Summary
Vi beskriver en enkel immunologisk att mäta produktion av proinflammatoriska cytokiner såsom IL-1 beta produktion, hos patienter med autoinflammatoriskt fenotyper. Genom att aktivera celler i helblod kulturer med patogen-associerade molekylära mönster, särskilt med lipopolysackarid kan cytokin sekretion vara lämpligt utvärderas i helblod supernatanterna.
Abstract
Inflammatoriska processer till följd av utsöndring av lösliga mediatorer av immunceller, leda till olika manifestationer i hud, leder och andra vävnader samt förändrad cytokin homeostas. Det medfödda immunförsvaret spelar en avgörande roll i erkännandet av patogener och andra endogena stimuli fara. En av de stora cytokiner släpptes av medfödda immunförsvaret celler Interleukin (IL) -1. Därför använder vi en hel test blod stimulans för att mäta utsöndringen av inflammatoriska cytokiner och särskilt av pro-inflammatoriska cytokin IL-1β 1, 2, 3.
Patienter med genetiska störningar på den medfödda immunförsvaret orsakar autoinflammatoriskt syndrom visar en överdriven frisättning av mogna IL-1β vid stimulering med LPS ensam. För att utvärdera det medfödda immunförsvaret del av patienter som får inflammatoriska-relaterade sjukdomar, använder vi en specifik immunologisk att detektera cellulära immunsvaret mot patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), såsom gramnegativa bakteriella endotoxiner, lipopolysackarid (LPS ). Dessa PAMPs är erkända av patogen erkännande receptorer (PRRS), som finns på celler i det medfödda immunförsvaret 4, 5, 6, 7. En primär signal, LPS, i kombination med en sekundär signal, ATP, är nödvändig för aktivering av inflammasome, en Multiproteinkomplex komplex som processer pro-IL-1β till sin mogna, bioaktiva formen 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Den helblodsanalys kräver minimalt urval manipulation för att bedöma cytokinproduktionen jämfört med andra metoder som kräver arbetsintensiv isolering och odling av specifika cellpopulationer. Denna metod skiljer sig från andra hela analyser blod stimulans, snarare än prover späddes med förhållandet RPMI media, vi utför ett antal vita blodkroppar direkt från utspätt helblod och därmed stimulera till ett känt antal vita blodkroppar i kultur 2. Resultaten av denna helblodsanalys demonstrera en ny teknik användbar i att belysa patientens kohorter uppvisar autoinflammatoriskt pathophysiologies.
Protocol
1. Insamling av helblod
- Skaffa en minst 10 mL perifert blod från drabbade individer såväl som ålder och kön matchade friska kontroller. Venblod skall samlas in i Vacutainer natriumheparin blodprovtagningsrör, snarare än att använda andra antikoagulanter, t ex EDTA, och vändas flera gånger för att säkerställa korrekt blandning med natrium heparin. Observera att 10 ml är den lägsta volymen av blod som behövs för plätering prover i duplikat för just denna analys.
- Prov bör behandlas så snart som möjligt efter provtagningen för bästa resultat. Däremot kan hepariniserat blod förvaras i rumstemperatur i dålig belysning upp till 24 timmar tills den ska behandlas (2).
2. Beredning av helblod
- Centrifugera alla blodprover vid 3000 rpm (med broms avstängd) i tio minuter i rumstemperatur. Utan att störa buffy coat, kan plasma samlas in från toppen och lagras för andra experimentella syften. Plasmaprover kan tillfälligt förvaras vid -20 ° C eller -80 ° C för långtidsförvaring
- När plasma samlas in, tvätta prover genom resuspending den röda blodkroppar (RBC) pelleten och lättcellsskikt med serum gratis (ofullständig) RPMI 1640 medier (vid rumstemperatur). Försiktigt pipett blandningen i samlingen rören och överför till en 50 ml koniska rör.
- Volym upp till 50 ml med ofullständiga RPMI 1640 odlingsmedia och vänd försiktigt rören för att skapa en homogen blandning. Centrifugera proverna vid 3000 rpm (med broms avstängd) i tio minuter. Att se det finns tydlig åtskillnad, aspirera supernatanten, försiktigt så att inte störa buffy coat. Upprepa proceduren 2-4 gånger för att säkerställa att alla föroreningar och bundna cytokiner tas bort före stimulering.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera RBC pelleten och lättcellsskikt så att den totala volymen är 20 ml (i 10 ml helblod initialt dras) med ofullständiga RPMI 1640 medier. Den totala volymen kan justeras baserat på den mängd blod från början utarbetats.
- Använda Cellometer Vision kan utspädd blod räknas utan lysering röda blodkroppar genom att välja vita alternativet blodkroppar med hjälp akridinorange (AO). Lägg en del spätt blodet med en del AO och belastning 20 mikroliter av 1:01 blandningen i en disponibel räknekammare. Den slutliga koncentrationen av AO efter utspädning bör 1μg/mL.
- Justera detta med ofullständiga RPMI 1640 media till en slutlig cell koncentration av 2,0 x 10 6 celler / ml.
3. Stimulering av helblod
- Analysen kräver minst fyra villkor (varje upprättats i två exemplar): ostimulerade, tillägg av LPS ensam, förutom av ATP ensam, och slutligen LPS plus ATP adderas. Tillsätt 1 ml av den färdigberedda 2,0 x 10 6 celler / ml utspädd helblod i rätt väl av en 24-och vävnadsodling plattan.
- Den stimulantia bör beredas och tas upp till rumstemperatur innan den stimulans analysen. Frystorkad LPS och ATP skall rekonstitueras enligt tillverkarens anvisningar. Efter beredning kan LPS och ATP spädas ytterligare till en ordentlig lager koncentration med ofullständiga RPMI 1640 medier.
- Lägg LPS till LPS bara liksom till LPS plus ATP väl så att den slutliga arbetar koncentrationen av LPS är 1 mikrogram / ml. Den totala stimulering är 3 timmar. Dock är helblod stimuleras med LPS i 2 timmar och 40 minuter. Proverna skall placeras i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2.
- ATP läggs under resterande 20 minuter av de 3 timmar stimulans period. Lägg ATP till ATP ensam och LPS och ATP väl och prover plats i inkubatorn. Den slutliga arbetar koncentrationen av ATP är 2mm.
- Efter 3 timmar inkubationstiden, samla supernatanterna av alikvotering varje prov i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och därefter centrifugering prov vid 10000 rpm i 2 minuter i rumstemperatur. Överför supernatanterna till en annan uppsättning 1,5 mikrocentrifugrör.
- Prover kan omedelbart analyseras eller lagras tillfälligt vid -20 ° C eller -80 ° C för långtidsförvaring.
4. Cytokine analys
- Prover som fryses behöver anta rumstemperatur före analys. Cytokin koncentrationer för IL-1βcan bedömas med hjälp av olika metoder. Vi använder Bio-Plex Pro mänskliga cytokin x komplex analys med Bio-Plex 200-systemet, enligt tillverkarens anvisningar. I detta protokoll vi specifikt mäter IL-1β, men vi utnyttjar denna analys multiplex cytokin för att samtidigt mäta flera cytokiner i en analys med fördel med en liten provvolym.
5. Representativa resultat
Analys av IL-1β produktion på framgångsrika stimulering med LPS och ATP visar en görse svar beroende på antalet celler som stimuleras. Vi har funnit att 2,0 x 10 6 celler / ml är en koncentration som är tillräcklig för att producera en optimal och mätbara koncentrationen av IL-1β samt andra cytokiner (Figur 2).
Helblod analyser är användbara för att studera patienter som uppvisar autoinflammatoriskt manifestationer. Dessa patienter kan visa en defekt i det medfödda immunförsvaret, som kan karakteriseras av överproduktion av IL-1β (jämfört med kontroller) vid stimulering med LPS ensam (Figur 3).
Figur 1. Representant bild av AO färgning för kärnförande vita blodkroppar som används för att bestämma cellkoncentrationen i utspädd helblod.
Figur 2. IL-1β produktionen mätt i helblod supernatanterna från en frisk donator vid stimulering med LPS öka cell koncentrationer. Proverna analyserades i tre exemplar.
Figur 3. Representativa resultat av IL-1β sekretionen mätt i helblod supernatanterna från två friska normala kontroller samt två patienter med IL-1β-associerade autoinflammatoriskt manifestationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den helblodsanalys beskrivs är en enkel metod som närmare efterliknar fysiologiska förhållanden jämfört med andra tekniker som skulle kräva cell isolering och omfattande urval bearbetning och manipulation. Denna metod utnyttjar Cellometer Vision med AO att räkna vita blodkroppar i blod och därmed ger möjlighet att exakt standardisera proverna baserade på cell nummer.
Det skall noteras att denna analys bör helblod dras in i samlingen natriumheparin tuber som andra antikoagulantia är kända kalcium kelater och kan därmed påverka resultaten av analysen. Serum fria medier bör också användas eftersom detta kan påverka cytokin koncentrationer. Också avgörande är omedelbar bearbetning av prover en gång erhållits. Medan den beskrivna metoden används LPS och ATP för att stimulera blod-och IL-1βconcentration, andra patogener och stimuli kan användas för att mäta olika cytokiner och svar kemokinreceptorantagonist på stimulans, men kan stimulans tider och villkor måste anpassas därefter. Slutligen kan konstant frys-tö-cykler påverkar cytokin koncentrationer.
Upptäckten av IL-1β använda hela analysen blodet stimulering beskrivs är ett alternativ till andra metoder och är ett effektivt immunanalys att studera sjukdomar med inflammatoriska-relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
