Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

Published: March 14, 2011 doi: 10.3791/2668
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, Rush University Medical Center

Summary

מבחני cytotoxicity למדוד טבעי התא הרוצח התגובות ממס ל-HIV נגועים בתאי מוגבל על ידי טוהר התאים היעד. אנו מדגימים כאן את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 נגוע T-cell תקיעות ראשונית על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4.

Abstract

טבעיים (NK) תאים הרוצח הם מרכיב חיוני של התגובה החיסונית המולדת תאים הנגועים בנגיף. חשוב להבין את היכולת של התאים נ"ח להכיר lyse HIV-1 תאים נגועים כי זיהוי כל aberrancy בתפקוד התא NK נגד HIV תאים הנגועים העלול להוביל לטיפולים כי היה לשפר את פעילות cytolytic שלהם. יש צורך להשתמש ב-HIV נגועים העיקרי T-cell תקיעות כמו תאים היעד דווקא אז נגוע-T-cell שורות מבחני cytotoxicity. T-cell הקווים, גם ללא זיהום, רגישים מאוד תמוגה התא NK. יתר על כן, יש צורך להשתמש תאים ראשוניים עצמיים כדי למנוע histocompatibility העיקריים מורכבים בכיתה אני חוסר התאמה בין המטרה לבין תא מפעיל כי תגרום תמוגה. מחקרים מוקדמים הערכת התגובות תא NK cytolytic ל-HIV נגועים תאים ראשוניים לא הצליחו להראות הרג משמעותי של 1,2 התאים הנגועים. עם זאת, שימוש ב-HIV-1 נגוע העיקרי מתאי T כמו תאים היעד מבחני תא NK פונקציונלי כבר קשה בשל נוכחותם של מזהמים תאים נגוע 3. זה תא נגוע עקבי יחס תא נגוע תגרום וריאציה בהריגת התא NK בין דגימות כי לא יכול להיות בגלל השתנות בתפקוד התא NK התורם. לכן, זה יהיה מועיל לעבוד עם האוכלוסייה מטוהרים תא נגוע כדי לתקנן את מפעיל למקד יחס בין תא ניסויים 3,4. כאן אנו מדגימים את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 תאים נגועים על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4 על תאים נגועים ואת הזמינות של ערכות מסחריות כדי להסיר תאים מתים או גוססים 3-6. מטוהרים נגוע העיקרי T-cell תקיעות אז יכול לשמש מטרות degranulation או assay ציטוטוקסיות עם מטוהרים תאים NK כמו האוכלוסייה מפעיל 5-7. השימוש בתאי NK כמו effectors ב assay degranulation מעריך את יכולתו של התא NK לשחרר את התוכן ממס של lysosomes המקצועית 8 בשם "גרגרי cytolytic". עד מכתים עם נוגדן מצומדות fluorochrome נגד CD107a, חלבון קרום lysosomal הופך הביע על פני התא NK כאשר גרגרי cytolytic הפתיל הממברנה פלזמה, אנו יכולים לקבוע איזה אחוז של תאים NK degranulate בתגובה היעד הכרה התא. לחילופין, פעילות NK תא ממס ניתן להעריך assay ציטוטוקסיות המאפשר קביעת אחוז התאים היעד lysed על ידי שחרור של 51 Cr מתוך תא המטרה בנוכחות תאים NK.

Protocol

1. בידוד של CD4 + T-האדם תאים דם היקפיים (ראה תרשים 1)

  1. דם ורידי היקפיים (40-60-MLS) נאסף לתוך Vacutainer צינורות המכילה הפרין סודיום (בקטון דיקנסון).
  2. הדם ההיקפיים הוא הועבר לאחר מכן מן Vacutainer צינורות עד 50 פוליסטירן צינורות מ"ל חרוטי (20 מ"ל של דם לכל צינור).
  3. RosetteSep CD4 + T-Cell מגיב בידוד (StemCell Technologies) נוסף בנפח 1 מ"ל ל מ"ל לא יותר מאשר 20 של דם בתוך שפופרת 50 מ"ל מעורב היטב.
  4. תערובת הוא מודגרות אז במשך 20 דקות בטמפרטורה 20-25 מעלות צלזיוס.
  5. אחרי 20 דקות, סידן ומגנזיום חינם (CMF) פוספט שנאגרו מלוחים [PBS (HyClone] w / 2% מומת חום (56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות) העובר שור בסרום [FBS (HyClone)] מתווספת תערובות על מנת להשיג נפח סופי של 40 מ"ל.
  6. תערובות מדולל (30 מ"ל) הם שכבתית אז על גבי 15 מ"ל של מדיום ההפרדה לימפוציטים [LSM (Cellgro)] ב טרי צינורות פוליסטירן 50 מ"ל חרוטי.
  7. 50 מ"ל צינורות הם centrifuged אז במשך 20 דקות עם הבלם ליד x 1200 גרם.
  8. 50 צינורות מ"ל יוסרו בצנטריפוגה בקפידה, כך את הממשק בין LSM ובינוניים אינה מופרעת. התאים בממשק נאספים עם 10 מ"ל פיפטה ו להציב לתוך צינורות טרי פוליסטירן 50 מ"ל חרוטי.
  9. הממשקים הם אספו מדולל PBS FBS w / 2% עד נפח סופי של 50 מ"ל.
  10. 50 צינורות מ"ל המכיל את ממשקי בדילול הם centrifuged ב 1200 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על.
  11. לאחר צנטריפוגה, supernatants הם aspirated וכדוריות resuspended ב 10 MLS של PBS w / 2% FBS.
  12. המתלים התא משולבים מכן לתוך צינור אחד מ"ל 50 חרוטי ומדולל ל 50 MLS עם PBS w / 2% FBS.
  13. שפופרת המכילה את ההשעיה תא המשולב centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר את כל LSM הנותרים.
  14. Supernatant היא aspirated ואת גלולה הוא resuspended אז 10 MLS של המדיום RPMI-1640 (HyClone) המכיל 10% FBS, 100 U / ml של פניצילין, 100 מק"ג / מ"ל של סטרפטומיצין (HyClone) ו - 2 מ"מ L-גלוטמין (CellGro ) (RPMI השלמה) וספר באמצעות hemocytometer.
  15. ריכוז של מטוהרים CD4 + T-תאים מותאם מכן 3x10 6 / mL עם RPMI השלמה.
  16. CD4 + 's מגורה לאחר מכן על ידי אותם culturing עם anti-CD3/anti-CD28 מצמידים את החרוזים [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi BIOTEC)] בשעה שלוש חרוזים לכל יחס תא במשך 72 שעות ב 37 מעלות של 5% C0 2 humidified חממה.

2. זיהום של CD4 + T-תאים עם HIV-1 (ראה תרשים 1)

  1. ההשעיה תא המכיל CD4 + T-מגורה תאים יוסרו מן הצלחת תרבות וספר באמצעות hemocytometer.
  2. CD4 + T-תאים (~ 2x10 6) מתווספים צינור חרוטי 15 מ"ל לשימוש כפקד נגוע.
  3. שאר CD4 + T-cell ההשעיה מושם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לזיהום.
  4. צינורות המכילים את CD4 + T-cell המתלים הם centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות ואת supernatant תרבות aspirated.
  5. CD4 + T-מגורה תאים הם resuspended ישירות נוזלים תרבות המכילה virions ואז ספין נגועים ב 1200 x g עבור 2 שעות 20-25 ° C 9. בדרך כלל אנו להדביק CD4 + T-תאים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5 עבור זן לקוי בשכפול HIV (למשל, DHIV-3) או משרד הפנים של 0.01 עבור וירוס שכפול המוסמכות (לדוגמה, HIV-1 NL4 / 3) . נפח הסופי אינו חשוב אלא צינורות חייבת להיות מאוזנת על צנטריפוגה. Polybrene (סנטה קרוז) הוא הוסיף נוזל התרבות לפני spinfection בריכוז סופי של 10 מק"ג / מ"ל.
  6. עם השלמת spinfection, supernatants יוסרו תאים resuspended בצפיפות תא של 3x10 6 / mL ב-RPMI מלא בתוספת 100 U / mL IL-2. התאים הנגועים נגוע הם תרבות במשך 72 שעות אם וירוס שכפול פסול שימש ידביק את התא או 5-7 ימים אם וירוס שכפול המוסמכת שימש להדביק את התאים. התקשורת צריכה להיות שונה בכל 48 שעות במהלך התרבות.

3. בידוד של האדם תאים הרוצח הטבעי של דם היקפיים

  1. דם ורידי היקפיים (~ 100 מ"ל) נאסף התורם אותה משמש כדי לבודד את CD4 + T-תאים לתוך Vacutainer צינורות המכילה הפרין סודיום (בקטון דיקנסון).
  2. הדם מועבר מן Vacutainer צינורות לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל 20 מ"ל aliquots.
  3. Vacutainer צינורות נשטפים אז עם 8 מ"ל של פתרון הנקס מלח CMF מאוזן [HBSS (Hyclone)] ואת שוטף מועברים 50 מ"ל conicals containiננוגרם למ"ל 20 של דם היקפיים. היקף וכתוצאה מכך כל 50 מ"ל חרוטי הוא 35 מ"ל.
  4. הדם מדולל הוא שכבתית אז על גבי 15 מ"ל של LSM בתוך צינור טרי 50 מ"ל חרוטי ואת צינורות centrifuged על x 400 גרם במשך 30 דקות עם הבלם משם.
  5. צינורות יוסרו בקפידה מתוך צנטריפוגה ואת ממשק הנובע בין LSM והבינוניים היא שנקטפו מן הצינור בכל באמצעות פיפטה 10 מ"ל ו להציב לתוך צינורות טרי 50 מ"ל חרוטי.
  6. המתלים התא נשטפים פעם עם CMF HBSS (centrifuged ב 400 x גרם במשך 15 דקות עם הבלם על).
  7. לאחר לשטוף הראשון supernatants מוסרים את כדורי כתוצאה משולבים לתוך 50 מ"ל יחיד חרוטי ורחץ פעמיים עם CMF HBSS (centrifuged ב x 30 גרם במשך 10 דקות עם הבלם ב) כדי להסיר את כל LSM הנותרים.
  8. לאחר לשטוף האחרון גלולה הוא resupended ב 10 מ"ל של חיץ תמוגה ACK (150 מ"מ NH 4 Cl, 1.0 מ"מ KHCO 3 ו 0.1 mM EDTA pH 7.3) ו מודגרות על טמפ החדר (20-25 ° C) למשך 5 דקות. צעד זה הכרחי על מנת להסיר אריתרוציטים לזהם מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC).
  9. אחרי 10 דקות. 40 מ"ל של CMF PBS מתווסף ההשעיה התא כדי לעצור את התגובה תמוגה.
  10. צינורית עם ההשעיה תא המכיל את אריתרוציטים PBMC ו lysed הוא centrifuged אז במשך 10 דקות עם הבלם על ב 300 x גרם.
  11. Supernatant מוסר את הכדור הוא resuspended ב 5 מ"ל של PBS עם 2% FBS ו 2 mM EDTA וספר באמצעות hemocytometer.
  12. טבעי (נ"ח) הרוצח תאים מבודדים אז מן PBMC באמצעות ערכת בידוד תא NK [בחירה אנושית שלילית (Miltenyi BIOTEC)] על פי הוראות היצרנים.
  13. זרימה דרך מעמודות נאספים צינורות 15ml ו הצינורות הם centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על.
  14. Supernatants יוסרו כדורי resuspended. כדורי resuspended משולבים צינור אחד בהיקף כולל של 1 מ"ל של מדיום שונה Iscove של של Dulbecco [IMDM (Gibco)] בתוספת 10% AB + חום מומת (56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות) בדם אנושי (HS) וספר עם hemacytometer.
  15. היקף ההשעיה תא מותאם עם HS IMDM w/10%, כך הצפיפות הסופית של התאים נ"ח הוא 3x10 6 / mL. המתלים התא לשניים. קבוצה אחת של תאים NK מקבל 200 U / mL של רקומביננטי אנושי interleukin-2. קבוצה אחרת של תאים נשאר בינוני ללא טיפול ציטוקינים.
  16. תרבויות התא NK מודגרת אז לילה בשעה 37 ° C CO, 5% 2
  17. התאים נ"ח וכתוצאה מכך משמשים כתאי מפעיל עבור assay או degranulation CD107a או 51 assay Cr לשחרר.

4. טיהור של HIV-1 תאים נגועים (ראה תרשים 1)

  1. נוזלים תרבות המכילה תאים נגועים יוסרו מן הצלחות ו centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על.
  2. Supernatant היא aspirated ואת כדורי הם resuspended ב 2 מ"ל של PBS עם 2% FBS ו 2 mM EDTA ותאי לסמוך hemocytometer.
  3. תאים נגועים שאינם מכילים HIV-1 מבודדים הרחק ידי ניצול העובדה HIV-1 למטה מודולציה CD4 מאלה כי הנמל וירוס. בשביל זה CD4 מטרה ערכת בידוד חיובי (Invitrogen) משמש על פי הוראות היצרנים למעט שאחד-CD4 חרוז לכל יחס תא משמש.
  4. לאחר הסרת CD4 + T-תאים, התאים המתים יוסרו מן האוכלוסייה תא מטוהרים מחסה את הנגיף באמצעות הסרת תאים מתים Kit (Miltenyi BIOTEC) בהתאם להוראות היצרנים.
  5. זרימה דרך הבאים הסרת תאים מתים בעמודות הוא centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על. Supernatant מוסר, כדורי resuspended ב 1 מ"ל RPMI-להשלים את התאים נספרים.
  6. תאים נגועים מטוהרים מוכנים כעת לשימוש מטרות assay degranulation CD107a או 51 assay Cr לשחרר.

5. CD107a Assay Degranulation (ראה איור 2)

  1. תרבויות NK תא יוסרו צלחות ההשעיה תא נספרת.
  2. המתלים NK תא centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על.
  3. תאים NK הם resuspended ב-RPMI להשלים את הריכוז הסופי מותאם 10 6 תאים / מ"ל.
  4. המתלים Cell מן נגוע נגוע מבודדים מתאי T שנוצר על השלבים שלעיל הם centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על.
  5. Supernatants יוסרו כדורי resuspended ב-RPMI להשלים בבית 2x10 6 תאים / מ"ל.
  6. K562 תאים משמשים כתאי מטרה חיובית שליטה, כפי שהם רגישים מאוד תמוגה NK. Tהוא התאים centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על, supernatants יוסרו כדורי resuspended ב-RPMI להשלים בבית 2x10 6 תאים / מ"ל
  7. ב 96-v-100 גם צלחת תחתית MCL של מטרות 100 effectors MCL מתווספים הבארות.
  8. גם המכיל 100 effectors mcLof ו 100 MCL של המדיום בלי תאים היעד ישמשו degranulation הלא ספציפית תא NK.
  9. לכל אחד גם 10 mcLFITC-מצומדות אנטי CD107a (BDIS) הוא הוסיף.
  10. צלחת היא centrifuged ואז במשך 2 דקות עם הבלם על בשעה 20 x גרם.
  11. צלחת centrifuged הוא מודגרות למשך 4 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  12. לאחר הצלחת הדגירה הוא centrifuged ב 400 x גרם במשך 5 דקות עם הבלם על.
  13. Supernatant מוסר את הכדור.
  14. גם כל מוכתם אז סך של 100 חיץ mcLof זרימה (PBS w / 2% לבין 0.1% FBS NaN 3) עם פאנל הבאה של fluorochrome-מצומדות נוגדנים על קרח במשך 20 דקות
    1. anti-CD3/14/20 [פסיפיק בלו, מצומדות (Biolegend)]
    2. אנטי CD56 [APC (Biolegend)]
  15. לאחר דגירה של 20 דקות, 200 MCL של חיץ תזרים מתווסף גם כל צלחת הוא centrifuged על x 400 גרם במשך 5 דקות עם הבלם על.
  16. חיץ זרימת לאחר מכן aspirated בקפידה מכל טוב באמצעות pipet 2 מ"ל aspirating מצויד טיפ MCL 200 micropipet תוך הקפדה שלא להפריע את הכדור.
  17. שלב 15 ו 16 חוזרים שוב.
  18. פתיתי הם resuspended ב 200 MCL paraformaldehyde של 1% ב CMF PBS. המתלים התא מועברים לאחר מכן צינורות הזרימה.
  19. סה"כ נפח מובא עד 300 MCL ידי הוספת ~ 100 MCL paraformaldehyde של 1% ב CMF PBS על צינור אחד.
  20. האירועים (2x10 4) המתאים תאים NK נאספים על ידי cytometer זרימה באמצעות DIVA FACS (BDIS) תוכנה עבור רכישת ונותחו באמצעות תוכנת תזרים ג'ו (TreeStar).

6. CD107a אסטרטגיה gating (ראה איור 3)

  1. השערים תא יחיד נוצרות באמצעות פיזור גובה קדימה (FSC-H) רוחב לעומת פיזור העלילה קדימה (FSC-W).
  2. עבור שטח מגרש מול גרעיניות פיזור לעומת FSC צד (SSC) העלילה נוצר על השער תא בודד. בדרך כלל יש לימפוציטים גרעיניות נמוכה יחסית תא בגודל בינוני.
  3. התאים בשער לימפוציטים הם זממו אז בעלילה נקודה של CD3/14/20 תאים מוכתם לעומת CD56 בתאי מוכתם לשער על תאים NK תוך השמטת מונוציטים (CD14) מתאי T (CD3) ו-B-תאים ( CD20).
  4. האוכלוסייה CD56 pos מגודרת מוערך אז עבור CD107a.
  5. התאים נ"ח ללא מטרות הקבוצה משמש כדי להגדיר את השערים עבור מה שנחשב CD107a שלילית.

7. Cr 51 Assay שחרור (ראה איור 4)

  1. תאים נגועים היעד מסומנים עם 125 mcCi 51 Cr (פרקין אלמר) ב saline/10 6 תאים עבור 2 שעות על סך של 500 MCL ב 37 ° C ו 5% CO 2. כביקורת חיובית K562 10 6 תאים מסומנים עם 100 mcCi 51 Cr עבור 2 שעות על סך של 500 MCL ב 37 ° C ו 5% CO 2. הנפח הכולל הוא הביא עד 500 MCL עם RPMI השלמה. נפח של 51 Cr הוסיף התאים היעד מחושב כאן: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
  2. בעוד התאים היעד הם תיוג, תאים מבודדים NK בעבר יוסרו תרבות וספר. בתרביות תאים המכיל תאים NK הם centrifuged ב 300 x גרם במשך 10 דקות עם הבלמים.
  3. פתיתי המכיל תאים NK הם resuspended ב-RPMI שלמה התפצלה 3 צינורות. צפיפות תא מותאם 10 5 / mL באחד צינור, 2.5x10 5 / ml בצינור השני 5x10 5 / mL בצינור השלישי.
  4. תווית תאים מטרות יוסרו מן החממה 4.5 מ"ל של RPMI השלמה מתווסף צינור אחד. צינורות הם centrifuged אז 300 x GF או 10 דקות.
  5. Supernatant היא ניגרה בזהירות שלא להפריע את הכדור לתוך מיכל של פסולת נוזלית רדיואקטיבי.
  6. שלבים 4 ו -5 חוזרים עוד פעמיים כדי להסיר את כל unabsorbed 51 Cr. Supernatants מן לשטוף השלישי עלול להיות מסולק במיכל לפסולת הלא רדיואקטיבי נוזלי.
  7. מטרות תווית הם resuspended אז RPMI השלמה לצפיפות תא הסופי של 10 5 / mL.
  8. 100 MCL מטרות שכותרתו הם aliquoted לתוך בארות צלחת 96-v-התחתונה היטב במשך מספר התא הסופי של 10 4 תאים היעד / היטב.
  9. טבלה 1 הוא דוגמה טיפוסית עבור ההתקנה assay Cr 51 שחרורו. כל קבוצה נעשית בשלושה עותקים.
    1 2 4 5 6 7 8 9
    K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01)
    ב UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01)
    ג HIV-1 E נגועים: T (1:1) HIV-1 E נגועים: T (1:1) HIV-1 E נגועים: T (1:1) HIV-1 E נגועים: T (2.5:1) HIV-1 E נגועים: T (2.5:1) HIV-1 E נגועים: T (2.5:1) HIV-1 E נגועים: T (1:1) HIV-1 E נגועים: T (1:1) HIV-1 E נגועים: T (1:1)
    D
    E
    F K562 ספונטנית שחרור K562 ספונטנית שחרור K562 ספונטנית שחרור UI ספונטנית שחרור UI ספונטנית שחרור UI ספונטנית שחרור HIV-1 שחרור ספונטנית מאשרום HIV-1 שחרור ספונטנית מאשרום HIV-1 שחרור ספונטנית מאשרום
    G K562 שחרור מרבי K562 שחרור מרבי K562 שחרור מרבי UI שחרור מרבי UI שחרור מרבי UI שחרור מרבי HIV-1 Maxmum אינפקטד שחרור HIV-1 Maxmum אינפקטד שחרור HIV-1 Maxmum אינפקטד שחרור
  10. 100 MCL של המתלים מעל תא NK מתווספים כל התאים היעד היטב המכיל.
  11. 100 MCL מטרות מתווספים בארות המקביל שבו תאים מפעיל נעדרים לקבוצות לשחרר מקסימלית ספונטנית. הקבוצה לשחרר ספונטנית הוא מודגרות עם תוספת של 100 MCL RPMI השלמה.
  12. צלחת 96-centrifuged גם היא ב x 20 גרם במשך 2 דקות עם הבלם על.
  13. צלחת centrifuged הוא מודגרות אז 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 4 שעות.
  14. לאחר 4 שעות 5 הדגירה MCL של דילול של 1:10 האדם כדוריות הדם האדומות RPMI השלמה מתווסף גם כל פרט בארות לשחרר מקסימלית.
  15. 100 MCL של סולפט 10% dodecyl נתרן מתווסף בארות לשחרר מקסימלית.
  16. צלחת היא centrifuged ב 400 x גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
  17. 100 MCL של supernatant תא ללא נאסף מכל טוב להציב לתוך גמא נגד צינורות נפרדים (פרקין אלמר). צינורות ממוקמים מונה 2470 גמא אוטומטי (פרקין אלמר). הסכום הנוכחי של Cr 51 בנוזל תרבות נמדדת כפי שקובע לדקה מן הממוצע של קריאה 2 דקות.
  18. ספירת לדקה (CPM) קריאות של דגימות בקרות משמשים כדי לחשב את תמוגה% ספציפי באמצעות המשוואה הבאה:
    [(CPM ניסיוני - ממוצע של CPM ספונטנית) / (ממוצע של עלות מקסימלית - כלומר על"ה ספונטנית)] 100 x

8. נציג תוצאות:

איור 1
באיור 1. צעדים מעורבים בידוד של תאים הרוצח הטבעי ואת הדור של HIV-1 התאים היעד נגועים מן הדם ההיקפי.

איור 2
איור 2. השלבים הכרוכים בבניית assay degranulation CD107a שימוש בתאי NK כמו effectors ו K562 תאים, נגוע CD4 + T-תאים נגועים ב-HIV-1 T-תאים כמטרות.

איור 3
איור 3. Cytometry-gating תזרים אסטרטגיה assay degranulation CD107a. (א) gating על תאים בודדים ללא גושים או כפילויות על מגרש של FSC-A (שטח פיזור קדימה) לעומת FSC-H (גובה פיזור קדימה). (ב) שער תא יחיד זממו כמו FSC-gating SSC (פיזור צד) vs על אוכלוסיית הלימפוציטים. (ג) שער הלימפוציטים זממו כמו CD3/14/20(T-תאים, מונוציטים, תאים B-) לעומת CD56 (תאים נ"ח) gating על האוכלוסייה CD56 pos andCD3/14/20 נג (NK השער). (ד) NK שער זממו כמו CD107a לעומת CD56 לדמיין בתאי NK כי יש degranulated (CD107a POS).

איור 4
איור 4. השלבים הכרוכים בבניית assay Cr 51 שחרור ניצול תאים NK כמו effectors ו K562 תאים, נגוע CD4 + T-תאים נגועים ב-HIV-1 T-תאים כמטרות.

איור 5
איור 5. תוצאות נציג להערכת התגובה ציטוטוקסיות של הרוצח טבעי נגד HIV-1 תאים נגועים. (א) תאים NK הוערכו על יכולתם degranulate ללא מטרות בתגובה K562 התאים CD4 העיקרי + T-תאים שנדבקו ב-HIV העיקרי מתאי T כפי שנבחנו על ידי באחוז התאים נ"ח כי CD107a לבטא את פני השטח. המספרים מייצגים בכל רבע אחוז של תאים NK מוחלט. ב) תאים NK מוערכות על היכולת שלהם lyse K562 תאים, נגוע CD4 + T-cell ו-HIV-1 נגוע T-תאים assay Cr 51 שחרור בתא מפעיל שונים למקד יחסי התא (E: T).

Discussion

כאשר נעשה בצורה נכונה מבחני המתואר בפרוטוקול זה אמור לספק תמונה מייצגת של יכולת התאים נ"ק כדי degranulate כנגד lyse HIV-1 תאים נגועים (ראה איור 5). Degranulation תא NK בתגובה ל-HIV נגועים התאים לתאי NK-HIV נגועים בתאי תמוגה צריך להיות ביחס ישר 10. תוצאות אמינות עבור שני מבחני תא NK פונקציונלי למדוד את התגובות ציטוטוקסיות ל-HIV נגועים בתאי תלויים הבידוד של מטוהרים מאוד תאים NK, כמו גם אוכלוסיה מטוהרים מאוד של תאים נגועים. לאחר מטוהרים בתאי NK ו - HIV-1 תאים נגועים הם קריטיים להשגת מפעיל מדויק למדי ליעד יחס התא. כמו כן, הסרת תאים מתים אפופטוטיים מן אוכלוסיות תאים יעד חשוב לפני תיוג Cr 51 או דגירה עם התאים מפעיל. Cr 51 עשוי להיות מופנמת על ידי התאים עוברים אפופטוזיס כמו נוכחות של תאים מתים או אפופטוטיים במהלך השלב תיוג איזוטופ תגרום לשחרור ספונטני גבוהה יהיה לעוות את תמוגה% מחושב ספציפית. יתר על כן, נוכחותם של תאים מתים או אפופטוטיים עלולה לעורר degranulation תא NK וכתוצאה מכך רמות גבוהות באופן חריג של הביטוי CD107a. Pipetting מדויק הוא הכרחי בעת הסרת תאים ללא supernatants הבאים הדגירה של תאים NK ותאי היעד של 51 מבחני Cr לשחרר, כמו הבדלים בהיקף supernatant להסיר לשכפל כל טוב תגרום סטיות תקן גבוהות. שינויים ניתן לבצע הפרוטוקולים הללו כדי להעריך את התפקיד של קולטנים ספציפיים NK מפעילה תמוגה NK של HIV לתאים תאים הנגועים על ידי דוגרים effectors או מטרות לקראת תרבות בשיתוף עם נוגדנים אנטגוניסטית לרצפטורים ספציפיים או ligands 6,11. ציטוקין שטופלו בתאי NK (למשל, IL-2, IL-15) ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקוד של תאים NK מגורה 12. כמו כן, תלוי נוגדן תא מבחני cytotoxicity ניתן לבצע בעזרת הפרוטוקולים הללו. נוגדנים נגד HIV (למשל, אנטי gp120) ניתן להוסיף את התאים היעד להכרה על ידי קולטן תא NK נמוך Fc זיקה CD16 13. מבחני אלה, למרות שהוקם כדי למדוד תגובות התא NK ציטוטוקסיות ל-HIV בתאים נגועים, יכול גם להיות שונה כדי למדוד את היכולת של התאים לייצר ציטוקינים NK הבאים הכרה HIV-נגוע התא. למרות שאנו המתואר פרוטוקול זה את השימוש בתאים במבחנה כמו תאים נגועים היעד שתיארנו לאחרונה את הדור של תאים היעד של חולים עם HIV. זה מצריך את בידודו של CD4 + T-תאים ואחריו התפשטות של התאים על פני תקופה של שבועיים בעקבות גירוי עם mitogens בנוכחות interleukin-2 11. לאחר תקופה שני בשבוע של התרחבות, הפרוטוקולים המתואר במאמר זה נעשה שימוש כדי לבודד את התאים היעד.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) BD Biosciences 367874
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit Stem Cell Technologies 15062
CMF PBS Hyclone SH30256.01
FBS Hyclone 10437-028
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01
Penicillin / Streptomycin Hyclone SV30010
L-glutamine Cellgro 25-005-Cl
T-cell Expansion Kit Miltenyi Biotec 130-091-441
CMF HBSS (1x) Hyclone SH30588.01
0.5M EDTA 46-034-Cl
NK Cell Negative Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-092-657
IMDM GIBCO, by Life Technologies 12440-046
CD4+ Positive Isolation Kit Invitrogen 113.31D
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Polybrene Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-134220
CD3 PacificBlue BD Biosciences 558117
CD14 PacificBlue Biolegend 325616
CD20 PacificBlue Biolegend 302328
CD56 APC Biolegend 318310
CD69 PE BD Biosciences 555531
CD107a FITC BD Biosciences 555800
51Chromium PerkinElmer, Inc. NEZ030002MC
Gamma Counter Tubes PerkinElmer, Inc. 1270-401
2470 Automatic Gamma Counter PerkinElmer, Inc. 2470-0050
FACS Diva BD Biosciences 643629
FlowJo Tree Star, Inc. FJ-9-1YR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
  2. Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
  3. Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
  4. Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
  5. Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
  6. Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
  7. Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
  8. Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
  9. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
  12. Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
  13. Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).

Tags

אימונולוגיה גיליון 49 חסינות מולדת HIV-1 התא הרוצח טבעי assay cytolytic assay degranulation לימפוציטים העיקרי
הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, Z. B., Ward, J. P., Barker,… More

Davis, Z. B., Ward, J. P., Barker, E. Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays. J. Vis. Exp. (49), e2668, doi:10.3791/2668 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter