Summary
Sitotoksisite deneyleri, HIV bulaşmış hücrelerin doğal öldürücü hücre litik tepkileri ölçmek için hedef hücreler saflığı ile sınırlıdır. Biz burada, HIV-1 yeteneğini CD4 aşağı modüle yararlanarak HIV-1 ile enfekte birincil T-hücre patlamaların son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir.
Abstract
Doğal öldürücü (NK) hücreleri, virüsle enfekte olan hücreleri doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hayati bir bileşendir. NK hücreleri, HIV ile infekte hücrelere karşı NK hücre fonksiyonu herhangi bir anormallik tespit, çünkü potansiyel olarak kendi sitolitik aktivitesini artıracak tedavilere yol açabilir HIV-1 enfekte hücreleri tanıma ve lyse yeteneğini anlamak için önemlidir. HIV ile enfekte olan birincil T-hücre patlamalar ziyade hedef hücreleri sitotoksisite deneyleri enfekte T-hücre hatları kullanmak için bir ihtiyaç vardır. T-hücre, hatta enfeksiyon olmadan, NK hücre lizis oldukça duyarlıdırlar. Ayrıca, hedef ve effektör hücre lizis neden olacaktır arasında uyumsuzlukları büyük doku uygunluk kompleksi sınıf önlemek için otolog birincil hücreler kullanmak için gerekli. Primer HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitolitik yanıtları değerlendiren ilk çalışmalar, enfekte olmuş hücreleri 1,2 önemli öldürme göstermek için başarısız oldu . Ancak, kullanarak, HIV-1 enfekte birincil NK hücre fonksiyonel analizde hedef hücreler olarak T hücreleri enfekte olmamış hücrelerdeki 3 kontamine varlığı nedeniyle zor olmuştur. Bu tutarsız enfekte hücrenin bulaşmamış hücre oranı donör NK hücre fonksiyonunu değişkenliği nedeniyle olmayabilir örnekleri arasında NK hücre öldürme varyasyon neden olacaktır. Bu nedenle, deneyler arasındaki hücre oranları 3,4 hedef efektör standardize etmek amacıyla bir saflaştırılmış enfekte hücrenin nüfusu ile çalışmak faydalı olacaktır. İşte biz, ölü ya da ölmekte olan hücrelerin 3-6 kaldırmak için, HIV-1 yeteneğini enfekte olmuş hücreleri ve ticari kitleri durumu aşağı modüle CD4 yararlanarak HIV-1 enfekte olmuş hücreleri, son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir. Saflaştırılmış enfekte birincil T-hücre patlamalar sonra nüfus olarak 5-7 efektör NK hücreleri saflaştırılmış bir degranülasyonu veya sitotoksik tahlil ya da hedef olarak kullanılabilir. NK hücreleri degranülasyonu tayininde effektör olarak kullanın 8 "sitolitik granül" olarak adlandırılan uzman lizozomlar litik içeriğini serbest bırakmak için bir NK hücre yeteneğini değerlendirir. Florokrom CD107a sitolitik granül plazma membranına sigorta NK hücre yüzeyinde eksprese olan bir lizozomal membran proteini karşı konjuge antikor ile boyanarak hücre tanıma hedef yanıt degranüle NK hücrelerinin yüzde belirleyebilirsiniz. Alternatif olarak, NK hücre litik aktivite, hedef hücreleri, NK hücreleri varlığı hedef hücre içinde 51 Cr salınımı ile parçalanmış yüzdesi tayini için izin veren bir sitotoksik tayininde değerlendirilebilir.
Protocol
1. İnsan CD4 + T Periferik Kan Hücreleri (bkz. Şekil 1) İzolasyon
- Periferik venöz kan (40 ila 60 mL) Vacutainer toplanır. Sodyum heparin (Becton Dickenson) içeren tüplere.
- Periferik kan Vacutainer aktarılır Tüpler, 50 ml konik tüpler polistiren (tüp başına kan 20 ml).
- RosetteSep CD4 + T hücre izolasyonu reaktifi (StemCell Teknolojileri) 50 ml tüp ve karışık kan 20'den fazla mL 1 ml hacmi eklenir.
- Bu karışım daha sonra 20-25 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
- 20 dakika, kalsiyum ve magnezyum (CMF) fosfat tamponlu sonra tuzlu [PBS (HyClone] w /% 2 ısı ile inaktive edilmiş (56 ° C'de 30 dakika) fetal sığır serumu [FBS (HyClone) eklenir karışımları 40 ml nihai hacmi elde etmek için.
- Seyreltilmiş karışımları (30 ml), daha sonra 15 mL Lenfosit Ayırma Orta üst katmanlı [EKK (Cellgro)] taze 50 ml konik tüpler polistiren.
- 50 ml tüpler sonra fren off 20 dakika boyunca 1200 x g de santrifüj.
- 50 ml tüpler LSM ve orta arasındaki arayüz rahatsız değildir, böylece santrifüj dikkatlice çıkarılır. Arayüzü hücreleri toplanır ve 10 ml pipet ile taze 50 ml polistiren konik tüpler içine yerleştirilir.
- Toplanan arayüzleri son hacim 50 mL PBS% w / 2 FBS ile seyreltilir.
- Seyreltilmiş arabirimleri içeren 50 ml tüpler freni ile 10 dakika boyunca 1200 x g santrifüj.
- Santrifüj sonra, süpernatantlar aspire ve pelet PBS w 10 mL /% 2 FBS yeniden süspanse.
- Hücre süspansiyonları daha sonra tek bir 50 ml konik tüp birleştirilir ve 50 mL PBS /% 2 FBS ile seyreltilir.
- Kombine hücre süspansiyonu içeren tüp kalan tüm LSM kaldırmak için, 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj .
- Süpernatant aspire edilir ve pelet sonra% 10 FBS, 100 U / ml penisilin, 100 mcg / ml streptomisin (HyClone) ve 2 mM L-glutamin (CellGro içeren 10 mL (HyClone) RPMI-1640 ortamı içinde yeniden süspanse ) (RPMI-tam) ve bir hemasitometre kullanarak sayılır.
- CD4 + T-Hücreleri saflaştırılmış konsantrasyon sonra 3x10 6 / ml RPMI-tam ayarlanır.
- CD4 + 'ın daha sonra kültür boncuk [T-Hücre Genişletme Kiti (Miltenyi Biotec)] 37 az 72 saat hücre başına düşen üç boncuk ° C% 5 C0 2 nemlendirilmiş birleştiğinde anti-CD3/anti-CD28 tarafından uyarılan inkübatör.
2. CD4 + HIV-1, T-Hücreleri (bkz. Şekil 1) Enfeksiyon
- Uyarılmış CD4 + T-Hücreleri içeren hücre süspansiyonu, kültür plakası çıkarılmış ve hemasitometre kullanarak sayılır.
- CD4 + T-hücrelerinin (~ 2x10 6) bulaşmamış kumanda olarak kullanmak için 15 ml konik tüp eklenir.
- Kalanı CD4 + T-hücre süspansiyonu enfeksiyon için 50 ml konik tüp yerleştirilir.
- CD4 + T-hücre süspansiyonları, 10 dakika ve kültür süpernatant 300 x g santrifüj içeren tüpler aspire edilir .
- Uyarılmış CD4 + T-Hücreleri virionlar içeren kültür sıvıları doğrudan yeniden süspanse ve daha sonra 2 saat boyunca 20-25 ° C 9 1200 x g spin-enfekte olan . Genelde biz bir çoğaltma yetkili virüs 0.01 çoğaltma eksik HIV suşu (örneğin, DHIV-3) ya da bir İçişleri Bakanlığı 5 enfeksiyon bir çokluk (İçişleri Bakanlığı) CD4 + T-hücrelerinin enfekte (örneğin, HIV-1 NL4 / 3) . Final hacmi önemsizdir ancak tüpler santrifüj için dengeli olmalıdır. Polybrene (Santa Cruz), son bir 10 mcg / ml konsantrasyonda önce spinfection kültür sıvısına eklenir .
- Spinfection tamamlanmasından sonra, süpernatantlar kaldırılır ve hücreler RPMI-100 U / ml, IL-2 ile desteklenmiş tam bir hücre yoğunluğu 3x10 6 / mL yeniden süspanse . Çoğaltma beceriksiz bir hücre veya çoğaltma yetkili bir virüsün, hücreleri enfekte etmek için kullanılan ise 5-7 gün virüs bulaştırmak için kullanılan enfekte olan ve olmayan hücreler 72 saat boyunca kültür. Medya kültürünün sırasında her 48 saatte bir değiştirilmesi gerekir.
3. Periferik Kan İnsan Doğal Öldürücü Hücreler izolasyonu
- Periferik venöz kan (~ 100 ml) Vacutainer içine CD4 + T hücreleri izole etmek için kullanılan aynı donörden toplanan Sodyum heparin (Becton Dickenson) içeren tüplere.
- Kan, daha sonra Vacutainer aktarılır Tüpler, 20 ml alikotları 50 ml konik tüpler içine.
- Vacutainer Tüpler ardından CMF Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi [HBSS (Hyclone)] 8 mL ile yıkanır ve yıkama 50 ml conicals containi aktarılırng periferik kan 20 ml. Her 50 ml konik hacmi, 35 ml.
- Seyreltilmiş kan sonra 15 LSK'nin ml ve 50 ml taze bir konik tüp fren off 30 dakika için 400 x g santrifüj tüpleri üst katmanlı.
- Tüpler santrifüj dikkatlice çıkarılır ve LSM ve orta arasında oluşan arayüz, 10 ml pipet kullanarak her bir tüpten hasat ve taze 50 ml konik tüpler içine yerleştirilir.
- Hücre süspansiyonları CMF HBSS (freni ile 15 dakika boyunca 400 x g santrifüj) ile bir kez yıkanır.
- Süpernatantlar ilk yıkamadan sonra kaldırılır ve ortaya çıkan pelet birleştirilir ve tek bir 50 ml konik içine kalan bütün LSM kaldırmak için CMF HBSS (freni ile 10 dakika boyunca 30 x g santrifüj) ile iki kez yıkanır.
- Son yıkama sonra pelet ACK lizis tamponu 10 ml resupended (150 mM NH 4 Cl, 1.0 mM KHCO 3 ve 0.1 mM EDTA, pH 7.3) ve 5 dakika oda sıcaklığında (20-25 ° C) inkübe. Bu adım, periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) kirlenmesine neden olan eritrositler kaldırmak için gereklidir.
- 10 dakika sonra. Lizis reaksiyonu durdurmak için CMF PBS 40 ml hücre süspansiyonu eklenir.
- PBMC ve parçalanan eritrositler içeren hücre süspansiyonu ile tüp sonra freni ile 10 dakika süreyle 300 x g santrifüj.
- Süpernatant kaldırılır ve pelet% 2 FBS ve 2 mM EDTA ve hemasitometre kullanarak sayılır 5 ml PBS içinde yeniden süspanse.
- Doğal öldürücü (NK) hücreleri, daha sonra [negatif seleksiyon-insan (Miltenyi Biotec)] üretici talimatlarına göre NK Hücre İzolasyon Kiti kullanarak PBMC izole edilmiştir .
- Sütunlarından akış 15ml tüpler toplanır ve tüpler 10 dakika fren x 300 g de santrifüj.
- Süpernatantlar kaldırılır ve pelet yeniden süspanse. Pelet yeniden süspanse Iscove Kullanıcı Modifiye Dulbecco'nun Kullanıcı Orta [IMDM (Gibco)] 1 ml hacimde bir tüp kombine olan% 10 AB inaktive + ısı (30 dakika 56 ° C) insan serum (HS) ile desteklenmiş ve bir sayılır hemasitometre.
- Hücre süspansiyonu hacmi IMDM w/10% HS NK hücreleri son yoğunluğu 3x10 6 / ml olacak şekilde ayarlanır. Hücre süspansiyonu, yarı yarıya bölünmüş durumda. NK hücreleri Bir set, 200 U / ml rekombinant insan interlökin-2 alır. Diğer hücreleri, sitokin tedavi olmadan orta bırakılır.
- NK hücre kültürleri sonra 37 ° C,% 5 CO 2 gece inkübe edilir
- Sonuçta elde edilen NK hücreleri, sonra CD107a degranülasyonu tahlil veya 51 Cr serbest tahlil için efektör hücreler olarak kullanılır .
4. HIV-1 Enfekte Hücre Arıtma (bkz. Şekil 1)
- Enfekte hücreler içeren kültür sıvıları plakaları çıkarılmış ve 300 x g freni ile 10 dakika süreyle santrifüj edilir.
- Süpernatant aspire edilir ve pelet bir hemasitometre sayılır% 2 FBS ve 2 mM EDTA ve hücreler ile 2 mL PBS içinde yeniden süspanse.
- HIV-1 aşağı CD4 modüle gerçeği yararlanarak virüs liman olanlar uzak, HIV-1 içermez enfekte hücreleri izole edilmiştir. Bu amaçla CD4 için Pozitif İzolasyon Kiti (Invitrogen) bir CD4 hücre başına düşen boncuk kullanılır hariç üretici talimatlarına göre kullanılır.
- CD4 + T-hücrelerinin kaldırılması üzerine, ölü hücreler, üretici talimatlarına göre Ölü Hücre Temizleme Kiti (Miltenyi Biotec) kullanarak virüs barındıran saflaştırılmış hücre popülasyonu kaldırılır .
- 300 x g akış yoluyla sütunlarda ölü hücre çıkarılmasını takiben fren ile 10 dakika süreyle santrifüj edilir. Süpernatant kaldırıldıktan sonra, 1 ml RPMI-tam pelet yeniden süspanse ve hücreler sayılır.
- Saflaştırılmış enfekte hücreleri artık bir CD107a degranülasyonu tahlil veya 51 Cr serbest tahlil hedefleri olarak kullanmak için hazırız.
5. CD107a degranülasyonu Testi (bkz. Şekil 2)
- NK hücre kültürleri tabakları kaldırılır ve hücre süspansiyonu sayılır.
- NK hücre süspansiyonlar, fren ile 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj .
- NK hücreleri RPMI-komple yeniden bekletildi ve son konsantrasyon 10 6 hücre / ml 'ye ayarlanır.
- Yukarıdaki adımları oluşturulan izole enfekte olan ve olmayan T-hücrelerinin hücre süspansiyonları freni ile 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj.
- Süpernatantlar kaldırılır ve pelet 2x10 6 hücre / ml RPMI-tam olarak yeniden süspanse.
- K562 hücreleri NK lizis için son derece duyarlı olduğu gibi, pozitif kontrol hedef hücreler olarak kullanılır. To hücreleri freni ile 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj, süpernatantlar 2x10 6 hücre / ml RPMI-tam kaldırılır ve pelet yeniden süspanse
- 96-v-oturaklı plaka 100 MCL hedefleri ve 100 MCL etkileyiciler kuyular eklenir.
- Hedef hücreleri olmadan 100 mcLof etkileyiciler ve orta 100 MCL içeren non-spesifik NK hücre degranülasyonu için kullanılacaktır.
- Her bir kuyunun 10 mcLFITC-konjuge anti-CD107a (BDIS) eklenir.
- Plaka freni ile 2 dakika sonra 20 x g santrifüj edilir.
- Santrifüje plaka, 37 ° C'de ve% 5 CO 2 4 saat inkübe edilir .
- Inkübasyondan sonra plaka freni ile 5 dakika boyunca 400 x g santrifüj edilir.
- Süpernatant pelet kaldırılır.
- Her iyi o zaman 100 mcLof akış tamponu (PBS /% 2 FBS ve% 0.1 NaN 3) toplam 20 dakika boyunca buz aşağıdaki panel florokrom-konjuge antikor ile boyandı
- anti-CD3/14/20 [Pasifik Mavi-konjuge (Biolegend)]
- anti-CD56 APC (Biolegend)]
- 200 MCL akışı, tampon, 20 dakika inkübasyondan sonra, her bir kuyunun eklenir ve plaka üzerinde fren ile 5 dakika boyunca 400 x g santrifüj .
- Her iyi pelet rahatsız etmemek için emin yaparken 200 MCL mikropipet ucu ile donatılmış 2 mL aspire pipetlemeyin kullanarak akışı, tampon sonra dikkatle aspire edilir.
- Adım 15 ve 16 bir kez daha tekrarlanır.
- Peletler CMF PBS içinde% 1 paraformaldehid 200 MCL yeniden süspanse. Hücre süspansiyonları sonra akış tüplerine aktarılır.
- CMF PBS içinde% 1 paraformaldehid ~ 100 MCL her tüpe ekleyerek toplam hacmi 300 MCL kadar getirdi.
- NK hücrelerine karşılık gelen olaylar (2x10 4) FACS DIVA (BDIS) satın alma için yazılım ve Akış Jo yazılımı (TreeStar) kullanılarak analiz kullanarak bir akış sitometresinin toplanır.
6. CD107a Ayırıcı Stratejisi (bkz. Şekil 3)
- Tek hücre kapıları forward scatter yüksekliği (FSC-H) vs ileri dağılım genişliği (FSC-W) arsa kullanılarak oluşturulur.
- FSC vs yan dağılım (SSC) arsa büyüklüğü karşısında taneciklik arsa için, tek bir hücre kapısı oluşturulur. Genelde lenfositler, nispeten düşük taneciklik ve orta hücre boyutu var.
- Monositler (CD14), T-hücrelerinin (CD3) ve B-hücrelerinin (atlayarak lenfosit kapısı hücreler daha sonra NK hücreleri CD3/14/20 boyanan hücreler vs. Kapısına CD56 boyanan hücrelerin bir nokta arsa çizilir CD20).
- CD56 pos kapılı nüfus CD107a için değerlendirilir.
- Hedefleri grup olmadan NK hücreleri için kapıları CD107a olumsuz olarak ne olduğunu belirlemek için kullanılır.
7 - 51 Cr Yayın Testi (bkz. Şekil 4)
- Enfekte hedef hücreleri 37 500 MCL toplam 2 saat saline/10 6 hücre 125 mcCi 51 Cr (Perkin Elmer) etiketli ° C ve% 5 CO 2. Pozitif kontrol olarak 10 6 K562 hücreleri 37 500 MCL toplam 2 saat için 100 mcCi 51 Cr etiketli ° C ve% 5 CO 2. Toplam hacmi RPMI-tam 500 MCL kadar getirdi. Cr hedef hücrelere 51 hacmi hesaplanır: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
- Hedef hücreleri etiketleme olsa da, daha önce izole edilen NK hücreleri kültür kaldırılır ve sayılır. NK hücreleri içeren hücre kültürleri üzerinde fren ile 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj.
- NK hücreleri içeren Peletler RPMI-tam olarak yeniden süspanse ve 3 tüp içine bölünür. Bir tüp, ikinci tüp 2.5x10 5 / ml ve üçüncü tüp 5x10 5 / ml 10 5 / ml hücre yoğunluğu ayarlanır.
- Etiketli hedefleri hücrelerin inkübatör kaldırılır ve her tüpe 4,5 ml RPMI-tam eklenir. Tüpler sonra 300 x gf ya da 10 dakika santrifüj edilir.
- Supernatant dikkatli bir şekilde radyoaktif sıvı atıklar için bir kap içine pelet rahatsız etmeyecek şekilde dökülür.
- 4. ve 5. adımları bütün emilmemiş 51 Cr kaldırmak için iki kez daha tekrarlanır. Üçüncü yıkama süpernatantlar olmayan radyoaktif sıvı atıklar için bir kap içinde atılmalıdır.
- Etiketli hedefler daha sonra nihai bir hücre yoğunluğu 10 5 / ml RPMI-tam olarak yeniden süspanse .
- Etiketli hedefleri 100 / 10 4 hedef hücreleri son bir hücre sayısı 96-v-alt plaka MCL kuyulara aliquoted.
- Tablo1 51 Cr serbest bırakma testi için tipik bir kurulum bir örnektir . Her grup, üç nüsha olarak yapılır.
1 2 4 5 6 7 8 9 A K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (2.5:1) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) B UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (2.5:1) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) C HIV-1 Enfekte E: T (1:1) HIV-1 Enfekte E: T (1:1) HIV-1 Enfekte E: T (1:1) HIV-1 Enfekte E: T (2.5:1) HIV-1 Enfekte E: T (2.5:1) HIV-1 Enfekte E: T (2.5:1) HIV-1 Enfekte E: T (1:1) HIV-1 Enfekte E: T (1:1) HIV-1 Enfekte E: T (1:1) D E F K562 Spontan sürümü K562 Spontan sürümü K562 Spontan sürümü UI Spontan Release UI Spontan Release UI Spontan Release HIV-1 Enfekte Spontan Yayın HIV-1 Enfekte Spontan Yayın HIV-1 Enfekte Spontan Yayın G K562 Maksimum sürümü K562 Maksimum sürümü K562 Maksimum sürümü UI Maksimum Yayın UI Maksimum Yayın UI Maksimum Yayın HIV-1 Enfekte Maxmum Yayın HIV-1 Enfekte Maxmum Yayın HIV-1 Enfekte Maxmum Yayın - 100 MCL yukarıdaki NK hücre süspansiyonları içeren yanı her bir hedef hücrelere eklenir.
- Hedeflerinin 100 MCL maksimum ve spontan yayın grupları için efektör hücrelerin yok olduğu karşılık gelen kuyulara eklenir. Spontan serbest grup RPMI-tam ek bir 100 MCL ile inkübe edilir.
- 96-plaka freni ile 2 dakika 20 x g santrifüj edilir.
- Santrifüje plaka sonra 37 inkübe ° C ve% 5 CO 2 4 saat.
- RPMI-tam insan kırmızı kan hücrelerinin bir 1:10 seyreltme 4 saat inkübasyon 5 MCL sonra maksimum sürüm kuyuları hariç her kuyuya eklenir.
- 100 MCL,% 10 sodyum dodesil sülfat, maksimum serbest kuyulara eklenir.
- Plaka pelet hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g santrifüj edilir.
- 100 MCL hücre mono her iyi hasat ve gama sayacı ayrı tüpleri (Perkin Elmer) yerleştirilir. Tüpler 2470 Otomatik Gama Sayıcı (Perkin Elmer) yerleştirilir. 51 Cr mevcut kültür sıvısının miktarı, dakikada ortalama 2 dakikalık bir okuma sayıları olarak ölçülür.
- Numuneleri ve kontrolleri dakikada sayar (CPM) okumaları aşağıdaki denklemi kullanarak belli lizis hesaplamak için kullanılır:
[(Deneysel CPM - spontan BGBM ortalaması) / (maksimum BGBM ortalama ortalama spontan BGBM)] x 100
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Merdivenleri ve doğal katil hücrelerin izolasyonu nesil HIV-1 enfekte hedef hücreleri periferik kan.
Şekil 2. Etkileyiciler ve K562 hücreleri enfekte olmamış CD4 + T hücreleri ve T-hücrelerinin hedef olarak HIV-1 olarak NK hücreleri kullanan bir CD107a degranülasyonu testinin inşaat dahil adımlar.
Şekil 3. CD107a degranülasyonu tahlil için flow sitometri yolluk strateji (A) bir arsa üzerinde tek hücre kümeleri veya çiftlerin hariç Ayırıcı FSC (forward scatter alan) vs FSC-H (forward scatter yükseklik). (B) Tek hücre kapısı lenfosit nüfus FSC vs SSC (yan dağılım) yolluk olarak çizilir. (C) Lenfosit kapısı CD3/14/20 olarak çizilen(T hücreleri, monositler, B hücreleri) vs CD56 CD56 pos andCD3/14/20 negatif nüfus (NK kapısı) (NK hücreleri) yolluk. (D) NK kapısı degranulated (CD107a pos) NK hücreleri görselleştirmek için CD107a vs CD56 olarak çizilir.
Şekil 4. Etkileyiciler ve K562 hücreleri enfekte olmamış CD4 + T hücreleri ve T-hücrelerinin hedef olarak HIV-1 olarak NK hücreleri kullanan 51 Cr serbest tahlil inşaat dahil adımlar.
Şekil 5. Karşı doğal öldürücü sitotoksik yanıt değerlendirilmesi için Temsilcisi sonuçları, HIV-1 enfekte olmuş hücreleri. (A) NK hücreleri hedefler olmadan ve K562 hücreleri yanıt degranüle için yetenekleri değerlendirilir edildi, birincil CD4 + T-hücrelerinin ve HIV bulaşmış birincil T-hücrelerinin ifade yüzey CD107a NK hücrelerinin yüzdesi ile değerlendirildi. Her kadranda numaraları toplam NK hücrelerinin yüzdesini temsil eder. T): B) NK hücreleri farklı efektör hücre hedef hücre oranları (E 51 Cr serbest tayininde K562 hücreleri, enfekte olmamış CD4 + T-hücre ve T-hücrelerinin HIV-1 lyse yeteneği değerlendirilir.
Discussion
Doğru yapıldığı zaman bu protokolü açıklanan Testler karşı degranüle ve HIV-1 enfekte olmuş hücreleri (bkz. Şekil 5) lyse NK hücreleri yeteneğini temsil eden bir resim sağlamalıdır. HIV ile enfekte olan hücreleri ve NK hücreleri lizis HIV ile enfekte olan hücreleri yanıt NK hücre degranülasyonu 10 doğru orantılı olmalıdır. HIV ile enfekte hücreleri sitotoksik tepkilerini ölçmek için iki NK hücre fonksiyonel testleri için güvenilir sonuçlar son derece NK hücrelerinin yanı sıra, son derece saf bir nüfusun enfekte hücreleri saflaştırılmış izolasyonu bağlıdır. Saflaştırılmış sahip NK hücreleri ve HIV-1 ile enfekte hücreler oldukça doğru efektör hücre oranı hedefi, başarı için kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, ölü ve apoptotik hücreleri hedef hücre popülasyonlarının kaldırılması efektör hücreleri ile 51 Cr etiketleme veya inkübasyon öncesinde önemli 51 Cr izotop etiketleme adım sırasında ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı olarak apoptoz gören hücreler tarafından içselleştirilmiş olabilir yüksek spontan sürümde neden olacak ve hesaplanan% özel lizis bozar. Ayrıca, ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı, CD107a ifade anormal derecede yüksek düzeyleri NK hücre degranülasyonu tetikleyebilir. Hassas pipetleme 51 Cr serbest tayinlerde, NK hücreleri ve hedef hücrelerin kuluçka aşağıdaki hücre süpernatantlar çıkarırken, gerekli her çoğaltmak kaldırıldı süpernatant hacmi farklılıkları gibi yüksek standart sapma neden olacaktır . Değişiklikler önce belirli reseptörleri veya ligandlar 6,11 antagonist antikorlar ile ko-kültür effektör veya hedefleri kuluçka NK hücreleri, HIV ile enfekte olan hücreleri lizis tetiklenmesi belirli NK reseptörleri rolünü değerlendirmek için bu protokoller yapılabilir . Sitokin tedavi edilen NK hücreleri (örneğin, IL-2, IL-15), NK hücreleri uyarılır 12 işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, bu protokolleri kullanarak antikor bağımlı hücre sitotoksisite testleri yapılabilir. Anti-HIV antikorların (örneğin, anti-gp120), NK hücre düşük afinite Fc reseptörü CD16 13 tarafından tanınması için hedef hücrelere eklenebilir . Bu deneyleri, HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitotoksik tepkileri ölçmek için kurulmuş olmasına rağmen aynı zamanda NK hücreleri, HIV ile enfekte hücre tanıma aşağıdaki sitokin üretme yeteneğini ölçmek için modifiye edilebilir. Biz bu protokolü in vitro enfekte olan hücreleri hedef hücreler olarak kullanımı tanımlanmış olsa da biz son nesil açıklanan hedef hücrelerin HIV ile enfekte olan hastaların var . Bu izolasyon CD4 + T-hücrelerinin hücrelerin genişlemesi, interlökin-2 (11) varlığında mitojenler ile uyarılmasını takiben bir iki hafta boyunca takip gerektirir. Genişleme iki haftalık bir süre sonra, bu makalede anlatılan protokoller hedef hücreleri izole etmek için kullanılır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) | BD Biosciences | 367874 | |
| RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit | Stem Cell Technologies | 15062 | |
| CMF PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| FBS | Hyclone | 10437-028 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | |
| Penicillin / Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-Cl | |
| T-cell Expansion Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | |
| CMF HBSS (1x) | Hyclone | SH30588.01 | |
| 0.5M EDTA | 46-034-Cl | ||
| NK Cell Negative Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| IMDM | GIBCO, by Life Technologies | 12440-046 | |
| CD4+ Positive Isolation Kit | Invitrogen | 113.31D | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-134220 | |
| CD3 PacificBlue | BD Biosciences | 558117 | |
| CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | |
| CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | |
| CD56 APC | Biolegend | 318310 | |
| CD69 PE | BD Biosciences | 555531 | |
| CD107a FITC | BD Biosciences | 555800 | |
| 51Chromium | PerkinElmer, Inc. | NEZ030002MC | |
| Gamma Counter Tubes | PerkinElmer, Inc. | 1270-401 | |
| 2470 Automatic Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | 2470-0050 | |
| FACS Diva | BD Biosciences | 643629 | |
| FlowJo | Tree Star, Inc. | FJ-9-1YR |
References
- Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
- Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
- Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
- Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
- Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
- Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
- Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
- Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
- Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
- Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
- Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).
