Summary
Este artigo detalha o procedimento de vídeo experimental para a obtenção da energia livre de Gibbs da dobradura de proteína de membrana por fluorescência de triptofano.
Abstract
Enovelamento de proteínas da membrana é um tema emergente com significado fundamental e saúde. A abundância de proteínas da membrana das células está subjacente a necessidade de estudo detalhado da dobragem desta família de proteínas onipresente. Além disso, os avanços na nossa capacidade de caracterizar doenças associadas com proteínas deformadas ter motivado significativos esforços experimentais e teóricos no campo de enovelamento de proteínas. Progresso rápido neste domínio importante é, infelizmente, dificultada pela desafios inerentes associados com proteínas da membrana e da complexidade do mecanismo de dobramento. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para medir a propriedade termodinâmica da energia livre de Gibbs de desdobramento, na ausência de desnaturante, Δ G ° H 2 O, por uma proteína de membrana representante integrante da E. coli. Este protocolo incide sobre a aplicação da espectroscopia de fluorescência para determinar as populações dos estados de equilíbrio dobrada e desdobrada em função da concentração de desnaturante. Considerações experimentais para a preparação de vesículas lipídicas sintéticas, bem como etapas fundamentais no processo de análise de dados são realçados. Esta técnica é versátil e pode ser perseguido com diferentes tipos de desnaturante, incluindo temperatura e pH, bem como em vários ambientes de dobramento de lipídios e micelas. O protocolo atual é aquele que pode ser generalizada para qualquer membrana ou proteína solúvel que atenda o conjunto de critérios discutidos abaixo.
Protocol
1. Preparação de ~ 50 nm de diâmetro pequenas vesículas Unilamelares (SUVs) para Folding proteína de membrana
- Uma solução de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) lipídios em clorofórmio é comprado e aliquotado em frascos de vidro limpo em 20 mg por frasco para armazenamento de quantidades. A camada de gás nitrogênio é adicionado a cada frasco para evitar a oxidação lipídica, e os frascos são selados com tampões e parafilme. Os frascos são armazenados em um freezer -20 ° C até o uso.
- Um único frasco que contém uma alíquota de 20 mg de lipídios em clorofórmio é usado para cada experimento. O conteúdo do frasco são secados usando um fluxo de gás nitrogênio por 1 hora até que não permanece solvente.
- Lipídios secas são ressuspendidos em 1 mL de tampão fosfato 20 mM de potássio (pH = 7.3) usando um sonicador banho-maria durante ~ 30 segundos. Esta solução de lipídios suspenso aparecerá nublado, e é transferido para um tubo de 15 mL de plástico com um fundo cônico. Outra alíquota de 1 mL de tampão fosfato é adicionado ao frasco de vidro vazio que originalmente continha lipídios e sonicação é repetido, a solução é então adicionado ao tubo de 15 mL mesma. Este processo é repetido um total de 4 vezes até que o volume final no tubo é de 4 mL, resultando em uma concentração de lipídios de 5 mg / mL desta solução vesícula estoque.
- O volume de 4 mL de solução vesícula lipídica é colocada num local quente (~ 30 ° C) banho de água e sonicado usando um MICROTIP ultrasonicator por 1 hora em ciclo de trabalho de 50%. A finalidade do banho de água é duplo. Primeiro, ela impede a solução de lipídios de tornar-se demasiado quente devido ao processo de sonicação. Segundo, o banho quente garante que a temperatura da solução aquosa de lipídios permanece acima da temperatura bicamada fase de transição durante sonicação; para DMPC, esta temperatura de transição é de aproximadamente 23 ° C.
- A solução sonicado é passado através de uma seringa 0,22 mM de filtro para remover detritos da ponta sonicador, e esta solução é filtrada equilibrada durante a noite a 37 ° C.
2. Preparação de amostra para Curva de fluorescência inicial Unfolding
- A solução estoque de 10 M de uréia em 20 mM tampão fosfato (pH 7,3) é feita. É essencial que a água ser adicionado ao sólido (e não vice-versa), pois a grande quantidade de uréia ocupa um volume significativo na solução. Esta solução de uréia pode ser feita pela adição de solutos para uma garrafa limpa e vazia e adicionando água até ao volume final pretendido. Esta solução pode exigir o aquecimento em banho-maria ou em uma chapa quente, mexendo para dissolver o soluto. Uréia é higroscópico e, portanto, a concentração real da solução estoque de uréia deve ser determinada através do índice de refração 1.
- Uma solução tampão estoque de 20 mM de fosfato (pH 7,3) é feita.
- Uma solução estoque de proteína é desdobrada preparado. Esta solução de proteína de ações deve ter uma concentração de proteína M ~ 200 em 8 de uréia M, tampão fosfato 20 mM.
- Amostras para estudos de fluorescência são preparados da seguinte maneira. Volumes adequados de proteína de ações (seção 2.3), a solução estoque de lipídeos (5 lipídica mg / mL, seção 1), estoque 10 solução de uréia M (seção 2.1) e tampão fosfato de estoque (seção 2.2) são combinados para fazer amostras contendo ~ 4 proteína M, 1 mg / mL de lipídios, e 0-8 M de uréia em incrementos de 1 M. O volume total de cada amostra é de 200 mL. Uma planilha exemplo (Tabela 1) está incluído o que volumes listas exigidas usando uma solução de proteína M 200 ações.
- Amostras em branco são feitas conforme descrito na seção 2.4, no entanto, a proteína não é adicionado. No lugar de proteína, 4 mL de uma solução de uréia 8 M podem ser adicionados para as concentrações de outros componentes são idênticos aos do ponto 2.4. Estes espaços são utilizados para subtrair espalhamento e sinal de fundo outra que aparece nos espectros de fluorescência da proteína.
- Amostras de seções 2.4 e 2.5 são autorizados a incubar a 37 ° C por pelo menos 2 horas antes da medição de espectros de fluorescência para garantir dobrar completa e equilíbrio.
3. Medição de espectros de fluorescência
Triptofano fluorescência de cada amostra e em branco é medida usando um fluorímetro steady-state. Espectros de fluorescência deve ser gravado com comprimento de onda de excitação de 290 nm para evitar a excitação de resíduos de tirosina, e digitalizados 305-500 nm. Entrada típica e bandpass de saída é de 3 nm. O incremento de comprimento de onda e tempo de integração pode ser otimizada para sinal-ruído. Valores típicos para o incremento de comprimento de onda e tempo de integração são 1 nm / etapa e 0,5 seg / step, respectivamente. Membrana proteínas em geral dobrar em lipídios sintéticos somente quando a temperatura está acima da temperatura bicamada fase de transição. Portanto, neste caso de DMPC, a temperatura da amostra é mantida constante em 30 ° C. A microvolume cubeta de sílica fundida com capacidade de 160 mL é utilizado nestes exexperimentos.
4. Geração de Curve Unfolding inicial e Estimativa da energia livre de Gibbs da proteína de membrana Unfolding
- Espectros de fluorescência na forma de um conjunto de dados xy são carregados no software, tais como Igor Pro, Matlab, Origin, ou Excel.
- Sinal do fundo da vesícula uréia e lipídeos deve ser subtraído utilizando o seguinte procedimento:
Spectrum A = espectro de fluorescência-prima de proteína na presença de vesículas lipídicas e de concentração específicos de uréia.
B = espectro espectro primas fluorescência de amostra em branco correspondente que contém vesículas lipídicas e concentração de uréia mesma que no espectro de A; nenhuma proteína nas amostras está em branco.
Spectrum Spectrum corrigido = A - C * espectro B. C é um escalar normalmente igual a 1,0. Em alguns casos, C é menor ou maior que 1.0 por causa de problemas de dispersão que causam sobre-ou sub-subtração perto da região nm ~ 305-320. - O comprimento de onda de máxima de fluorescência, λ max, é tabulados a partir de espectros corrigidos para cada concentração de uréia. Um valor típico para a plena desdobrado proteína de membrana é de 350 nm, enquanto a de proteína dobrada é de aproximadamente 330 nm. Comprimentos de onda tabelados são convertidos em fração desdobrado convertendo o intervalo de valores λ max (~ 330 a ~ 350 nm) para a faixa 0,0-1,0 correlacionar a λ valor máximo a fração da população se desenrolava. Por exemplo, um valor máximo de λ 330 nm corresponde a 0,0, a 350 nm corresponde a 1,0, e 340 nm corresponde a 0,5 em termos de fração desdobrado. Esta fração de proteína é, então, desdobrado plotado contra a concentração de uréia. Como dito acima, a concentração de uréia deve ser determinada experimentalmente através da medição do índice de refração.
- Supomos que a proteína pode existir em um dos dois estados: dobrado ou desdobrado. O enredo da fração desdobrado, f, versus concentração de uréia, C, pode estar em forma para a equação: 2
O coeficiente de m corresponde à taxa de variação da energia livre com respeito à concentração desnaturante e C m corresponde à concentração de uréia no ponto médio em que a população dobrada é igual a população se desenrolava. Estes valores são as variáveis encaixe obtido a partir de ajuste dos mínimos quadrados por dados software de análise. R (0.001987 kcal / mol • K) é a lei do gás constante, e T é a temperatura (303 K). - Os coeficientes obtidos a partir do ajuste são utilizadas para determinar a energia livre de Gibbs (kcal / mol) de desdobramento, na ausência de uréia:
.
. 5. Otimizado Unfolding Curva para medições mais precisas de energia livre de Gibbs de desdobramento.
- A curva de desdobramento descrito acima revela a gama de concentrações de uréia que faz com que a maior mudança no λ max. Esta gama é normalmente pequeno, ea maioria de desdobramento ocorre dentro desta faixa de pequeno porte. , A fim de determinar com precisão a energia livre de desdobramento, amostras adicionais são analisados nesta região para obter um lote que contém muitos pontos dados necessários para a montagem dos mínimos quadrados otimizado. Por exemplo, se a proteína se desdobra entre 2 e 4 de uréia M, as amostras podem ser feitas que contêm 2-4 M de uréia em incrementos de 0,2 M para revelar mais precisamente a forma desta importante região da curva de desenvolvimento. Não é necessário medir espectros em branco em cada concentração de uréia, é suficiente para medir um espectro em branco a cada passo ~ 0,5 M.
- A energia livre de desdobramento obtido a partir deste enredo pode ser ligeiramente diferente do obtido na curva original desdobramento, mas reflete um valor mais preciso.
6. Resultados representativos:
| Amostra | final [uréia], M | proteína de ações (mL) | lipídica de ações (mL) | estoque 10 M uréia (mL) | estoque regulador (mL) |
| 1 | ~ 0,16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
Tabela 1. Volume das soluções de reserva necessária para fazer amostras de fluorescência
Figura 1. Triptofano espectros de fluorescência de ~ 5 proteína de membrana M representante que contém um resíduo de triptofano único. (A) Espectros de fluorescência da proteína Raw (Um espectro de 4,2), (B) Raw espectros de fluorescência de branco (espectro B de 4,2), (C) Corrigido espectro de 4,2.
Figura 2. Corrigida triptofano espectros de fluorescência da proteína de membrana a partir da Figura 1 para as concentrações de uréia numerosos.
Figura 3. Unfolding curva obtida a partir de dados na Figura 2, com ajuste para a equação em 4,4. A energia livre de Gibbs é calculado de acordo com a secção 4.5.
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Discussion
O protocolo atual descreve a geração de curvas de desdobramento da membrana-associados proteínas e peptídeos que contêm resíduos de triptofano. Aqui, presume-se que a fluorescência de triptofano reflete se a proteína é dobrado e inserido em vesículas lipídicas sintéticas, ou desdobrado em solução. Suposições adicionais, tais como dois estados dobrar e dependência linear de energia livre com a concentração de desnaturante, são feitas no presente relatório;. Modificação destes pressupostos resultado em diferentes equações 2 O protocolo experimental pode ser facilmente modificado para utilizar diferentes observáveis espectroscópicos, tais como dicroísmo circular, de absorção, ou de fluorescência de um corante extrínsecos, 3, bem como eletroforese em gel. 4 Além disso, desnaturantes diferentes, tais como guanidinium, soluções ácidas, ou temperatura, bem como lipídios alternativa / vesículas, como lipídios aniônicos, grandes vesículas unilamelares, ou micelas, pode ser utilizado. 5,6 Finalmente, o protocolo pode ser aplicado a qualquer proteína de membrana, membrana-associada de peptídeos, proteínas e peptídeos / solúveis que atenda aos critérios de dobrar reversível, e que exibe uma espectroscópicas ou outros marcador observáveis para diferentes estados conformacionais. No caso de proteínas solúveis, as vesículas são obviamente omitido o protocolo.
Gibbs energia livre de desdobramento fornece insights sobre as interações não covalentes que estabilizam biomoléculas. Em nosso laboratório, temos medido desdobramento curvas para os mutantes da proteína de membrana externa A (OmpA) que contêm resíduos de triptofano único em diferentes locais, e informou que os mutantes foram desestabilizadas em relação à proteína do tipo selvagem que contém cinco resíduos de triptofano nativa. 7 Estes estudos desdobramento são complementados por outras técnicas, incluindo espectroscopia vibracional, para elucidar detalhes moleculares, por exemplo, ligações de hidrogênio e interações de pares que estão na base da variação na estabilidade. Em resumo, a técnica relativamente simples de curvas de desdobramento pode ser aplicado a membrana e proteínas solúveis para revelar termodinâmica associada com o dobramento de proteínas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Beijing Wu para uso de seus dados. Este trabalho foi financiado por uma concessão de CARREIRA NSF para Jek
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P288 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285 |
References
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