Summary
Это видео подробно статье экспериментальные процедуры получения свободной энергии Гиббса мембранных складывания белка триптофан флуоресценции.
Abstract
Складные Мембранные белки новые темы с как фундаментальных, так и связанных со здоровьем значение. Обилие мембранных белков в клетках лежит необходимость всестороннего изучения складывания этого вездесущего семейства белков. Кроме того, прогресс в нашей способности характеризуют заболевания, связанные с неправильно упакованных белков побудили значительные экспериментальные и теоретические усилия в области сворачивания белка. Быстрый прогресс в этой важной области, к сожалению, затруднено из-за присущих проблем, связанных с мембраной белков и сложности механизм складывания. Здесь мы опишем экспериментальные методики измерения термодинамических свойств Гиббса свободная энергия разворачивается в отсутствие денатуранта, Δ G ° H 2 O, для представителей интегрального мембранного белка от E. палочки. Этот протокол фокусируется на применение флуоресцентной спектроскопии для определения равновесия популяций свернутых и развернутых состояний в зависимости от денатуранта концентрации. Экспериментальные соображения для подготовки синтетические везикулы липидного, а также основные этапы процедуры анализа данных будут выделены. Этот метод является универсальным и может осуществляться с различными типами денатуранта, включая температуру и рН, а также в различных средах складной липидов и мицеллы. Текущий протокол, который может быть обобщен на любое мембраны или растворимого белка, который отвечает набору критериев обсуждается ниже.
Protocol
1. Подготовка ~ 50 нм Диаметр малого однослойные везикулы (SUV) для мембранных белков Складные
- Решение 1,2-dimyristoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин (ДМФХ) липидов в хлороформе приобретается и aliquotted в чистые стеклянные флаконы по 20 мг на флакон количествах для хранения. Слой газообразного азота добавляется к каждому флакон для предотвращения окисления липидов, а флаконы запечатаны с колпачками и парафильмом. Флаконы хранятся в -20 ° C морозильнике до использования.
- Одном флаконе, который содержит аликвоту 20 мг липида в хлороформ используется для каждого эксперимента. Содержимое флакона сушат с помощью потока газообразного азота в течение 1 часа, пока не растворителя остается.
- Сушеные липидов ресуспендируют в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера калия (рН = 7,3), используя sonicator водяной бане в течение 30 секунд. Это решение взвешенных липидного появится облачно, и переносится на пластиковую 15-мл трубки с коническим дном. Еще 1 мл аликвоту фосфатного буфера добавляется в пустой стеклянный пузырек, который первоначально содержащиеся липидов, и ультразвуком повторяется; раствор затем добавил к тому же 15-мл трубки. Этот процесс повторяется в общей сложности 4 раза, пока конечный объем в трубке 4 мл, в результате чего липидного концентрации 5 мг / мл в этом растворе пузырьков акций.
- 4 мл объема липидных везикул решение находится в теплой (~ 30 ° С) водой ванну, и обрабатывали ультразвуком использованием ultrasonicator микроострийных в течение 1 часа при 50% рабочего цикла. Цель водяной бане двояка. Во-первых, он предотвращает липидного решение стать слишком жарко из-за озвучивания процесса. Во-вторых, теплая ванна гарантирует, что температура водного раствора липидный остается выше бислоя температуры фазового перехода во время обработки ультразвуком, для ДМФХ, этот переход температуры ~ 23 ° C.
- Ультразвуком раствор пропускается через шприц 0,22 мкм фильтр для удаления мусора с sonicator чаевые, и этот отфильтрованный раствор находится в равновесии в течение ночи при температуре 37 ° C.
2. Подготовка образцов для начальной флуоресценции Развернув Кривая
- Исходного раствора 10 М мочевины в 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,3) сделан. Очень важно, чтобы вода быть добавлены к твердой (а не наоборот), потому что большое количество мочевины занимает значительный объем в растворе. Этот раствор мочевины может быть сделано путем добавления растворенных веществ в чистую, пустую бутылку и добавляют воду до предполагаемого конечного объема. Это решение может потребовать потепления на водяной бане или на горячей плите при помешивании, чтобы растворить вещества. Мочевина гигроскопичен и, следовательно, фактическая концентрация исходного раствора мочевины должны быть определены с помощью преломления 1.
- Маточного раствора буфера 20 мМ фосфата (рН 7,3) сделан.
- Исходный раствор развернутого белка подготовлен. Это решение фондовом белка должна иметь концентрацию ~ 200 мкМ белка в 8 М мочевины, 20 мМ фосфатного буфера.
- Образцы для исследования флуоресценции готовят следующим образом. Соответствующие объемы запасов белка (раздел 2.3), фондовые липидного раствора (5 мг / мл липидного, раздел 1), акции 10 М раствора мочевины (раздел 2.1), а фондовый фосфатного буфера (раздел 2.2) объединяются, чтобы сделать образцы, содержащие ~ 4 мкМ белка, 1 мг / мл липидов, и от 0 до 8 М мочевины с шагом 1 M. Общий объем каждого образца составляет 200 мкл. Например таблицу (табл. 1) входит в котором перечислены необходимые объемы использования 200 мкМ фондовом раствора белка.
- Пустые образцы, как описано в разделе 2.4, тем не менее, белок не добавляется. На месте белка, 4 мкл 8 М раствора мочевины могут быть добавлены так концентраций других компонентов идентичны тем, в разделе 2.4. Эти заготовки используются для вычитания рассеяния и других фонового сигнала, который появляется в спектрах флуоресценции белка.
- Образцы из разделов 2.4 и 2.5 разрешают инкубировать при температуре 37 ° С в течение по крайней мере за 2 часа до измерения спектров флуоресценции для обеспечения полного складывания и уравновешивания.
3. Измерение спектров флуоресценции
Триптофан флуоресценцию каждого образца и пустые измеряется с помощью стационарных флуорометр. Спектры флуоресценции должны регистрироваться при возбуждении длиной волны 290 нм, чтобы избежать возбуждения остатков тирозина, и отсканированные с 305 до 500 нм. Типичные входа и выхода полосового составляет 3 нм. Приращение длины волны и времени интегрирования могут быть оптимизированы для сигнал-шум. Типичные значения для приращения длины волны и временем интегрирования от 1 нм / шаг и 0,5 сек / шаг, соответственно. Мембранные белки как правило раз в синтетические липиды только тогда, когда температура выше бислоя температуры фазового перехода. Поэтому в данном случае ДМФХ, температура образца поддерживается постоянным при температуре 30 ° C. Микрообъеме плавленого кремнезема кювету с 160 мкл мощности используется в этих бывшихэкспериментов.
4. Генерация Первоначальные Развернув Кривая и оценка свободной энергии Гиббса мембранных белков Развернув
- Спектры флуоресценции в виде набора данных ху загружаются в программное обеспечение, такое как Игорь Pro, Matlab, происхождения или Excel.
- Сигнал от фона пузырь мочевины и липидов необходимо вычесть, используя следующую процедуру:
Спектр = сырья спектр флуоресценции белка в присутствии липидные пузырьки и определенной концентрации мочевины.
Спектр B = сырья спектр флуоресценции соответствующей пустой образец, который содержит липидные пузырьки и той же концентрации мочевины, как и в спектре, нет белка в пустых проб.
Исправлено Спектр Спектр = - С * спектр Б. С скалярное правило, равна 1,0. В некоторых случаях, C меньше или больше 1,0 из-за рассеяния вопросы, которые вызывают более или недостаточно вычитание около ~ 305-320 нм. - Длина волны максимальной флуоресценции, λ макс, протабулирована от исправлены спектры для каждой концентрации мочевины. Типичное значение для полностью развернутой мембранного белка составляет 350 нм, в то время как сложенными белка составляет ~ 330 нм. Табличные длин волн преобразуются в часть, развернутая преобразование диапазона значений λ макс (~ 330 до ~ 350 нм) в диапазоне от 0,0 до 1,0 соотнести значение λ макс на долю развернутой населения. Например, значение λ максимум 330 нм соответствует 0,0, 350 нм соответствует 1,0 и 340 нм соответствует 0,5 с точки зрения доли развернулся. Эта доля развернутых белок затем заговор против концентрации мочевины. Как указывалось выше, концентрация мочевины должен быть определен экспериментальным путем измерения показателя преломления.
- Мы предполагаем, что белок может находиться в одном из двух состояний: сложенном или развернутом. Участок фракции развернулась, е, по сравнению концентрации мочевины, С, может быть пригодным к уравнению: 2
Коэффициент м соответствует скорости изменения свободной энергии по концентрации денатуранта и С м соответствует концентрации мочевины середину, при которой сложенном среди населения, составила развернулась населения. Эти значения установки переменных, полученные из наименьших квадратов установки программного обеспечения анализа данных. R (0.001987 ккал / моль • К) газа закона постоянная, Т не зависит от температуры (303 К). - Коэффициенты, полученные из подгонки используются для определения свободной энергии Гиббса (ккал / моль) разворачивается в отсутствии мочевины:
.
. 5. Оптимизированная Развернув Кривая для более точного измерения свободной энергии Гиббса Развернув.
- Разворачиваются описанные выше кривой показывает диапазон мочевины, которая вызывает наибольшие изменения в λ макс. Этот диапазон, как правило, мало, и большинство разворачивается происходит в пределах этого небольшого диапазона. Для того, чтобы точно определить свободную энергию разворачивается, дополнительные пробы анализируются в этом регионе, чтобы получить участок, который содержит много точек данных, необходимых для оптимизации наименьших квадратов примерки. Например, если белок разворачивается между 2 и 4 М мочевины, образцы могут быть сделаны, которые содержат 2 - 4 М мочевины в 0,2 М шагом, чтобы более точно выявить форму этом важном регионе в разворачивающейся кривой. Не стоит измерять спектры пустой на каждой концентрации мочевины, это достаточно измерить пустой спектр каждые ~ 0,5 М шаг.
- Свободная энергия разворачивается получается из этого участка может немного отличаться от полученного в оригинальной разворачивается кривой, но отражает более точное значение.
6. Представитель Результаты:
| Образец | Окончательный [Мочевина], М | акции белка (мкл) | акции липидов (мкл) | акции 10 М мочевины (мкл) | акции буфер (мкл) |
| 1 | ~ 0,16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
Таблица 1. Объем фондового решений, необходимых, чтобы сделать флуоресценции образцов
Рисунок 1. Триптофан флуоресценции ~ 5 мкМ представитель мембранный белок, который содержит один остаток триптофана. () Сырье флуоресценции белка (спектр от 4,2), (B) Сырье флуоресценции пустой (спектр В, из 4,2), (С) Исправлено спектр от 4,2.
Рисунок 2. Исправлено триптофан флуоресценции мембранных белков из рисунка 1 для многочисленных концентрации мочевины.
Рисунок 3. Развернув кривой, полученной из данных на рисунке 2, с нужным уравнением в п. 4.4. Свободной энергии Гиббса рассчитывается в соответствии с разделом 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий протокол описывает поколение разворачивается кривые мембранно-связанных белков и пептидов, которые содержат триптофан остатков. Здесь предполагается, что флуоресценции триптофана, отражает ли белок складывается и вставляется в синтетические пузырьки липидов, или развернутой в растворе. Дополнительные предположения, например, двух государств, складывания и линейная зависимость свободной энергии денатуранта концентрации, производятся в настоящем докладе;. Модификации этих предположений в результате различных уравнений 2 экспериментальный протокол может быть легко модифицирована для использования различных спектроскопических наблюдаемых, таких как круговой дихроизм, поглощения или флуоресценции от внешних красителя, 3, а также гель-электрофореза. 4 Кроме того, различные denaturants, такие, как гуанидин, кислые растворы, или температуры, а также альтернативные липидов / пузырьки, такие как анионные липиды, большой однослойные везикулы, или мицеллы, могут быть использованы. 5,6 Наконец, протокол может быть применен к любой мембранных белков, мембран-связанные пептиды, и растворимого белка / пептид, который соответствует критериям обратимым складывающиеся, и что экспонаты спектроскопических или других наблюдаемых маркер для различных конформационных состояний. В случае растворимые белки, везикулы, очевидно, исключены из протокола.
Свободная энергия Гиббса разворачивается дает представление о нековалентных взаимодействий, стабилизирующих биомолекул. В нашей лаборатории мы измерили разворачивается кривые для мутантов белок наружной мембраны (OmpA), которые содержат одну остатков триптофана в разных местах, и сообщил, что мутанты дестабилизировали относительно дикого типа белка, который содержит пять родных остатки триптофана 7. Эти разворачиваются исследования дополняются другими методами, в том числе колебательной спектроскопии для выяснения молекулярной детали, например, водородные связи и парных взаимодействий, лежащих в основе изменений в стабильности. Таким образом, относительно простой метод раскрытия кривые могут быть применены к мембране и растворимые белки выявления термодинамики связано с сворачивания белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Пекина Ву для использования ее данных. Эта работа была поддержана наградой NSF КАРЬЕРА для Jek
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P288 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285 |
References
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
