Summary
Bu video makalede, triptofan floresan membran protein katlanması Gibbs serbest enerji elde etmek için deneysel prosedür.
Abstract
Membran protein katlanması ve sağlıkla ilgili temel öneme sahip bir konudur. Membran proteinleri hücrelerin temelini bu proteinlerin her yerde aile katlanır kapsamlı bir çalışma için ihtiyaç bolluğu. Ayrıca, misfolded proteinler ile ilişkili hastalıklar karakterize yeteneğimizi gelişmeler, protein katlanması konusunda önemli deneysel ve teorik çabaları motive etmiş. Bu önemli alanda hızlı bir ilerleme maalesef, membran proteinleri ve katlama mekanizması karmaşıklığı ile ilişkili içsel zorluklar tarafından engellenmektedir. Burada, biz, E. bir temsilci integral membran proteini denaturant yokluğunda, Δ G ° H 2 O açılmadaki Gibbs serbest enerji termodinamik özelliği ölçmek için deneysel bir prosedür anahat coli. Bu protokol, denaturant konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak katlanmış ve gelişeceğini devletlerin denge nüfusu belirlemek için floresans spektroskopisi uygulanması üzerinde duruluyor. Sentetik lipid veziküller yanı sıra veri analizi prosedürü önemli adımlar hazırlanması için deneysel düşünceler vurgulanır. Bu teknik, çok yönlüdür ve denaturant sıcaklık ve pH yanı sıra lipidler ve miseller çeşitli katlanır ortamlar da dahil olmak üzere farklı tipleri ile takip edilebilir. Geçerli protokol kriterler aşağıda tartışılmıştır karşılayan herhangi bir membran veya çözünebilir protein jeneralize olabilir.
Protocol
1. Membran Protein katlanması için ~ 50 nm Çapı Küçük Unilamellar veziküller (SUV) hazırlanması
- 1,2-dimyristoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DMPC) kloroform lipidlerin bir çözüm başına 20 mg flakon miktarlarda depolama için satın alınan ve temiz bir cam şişe içine aliquotted. Azot gazı bir katman yağ oksidasyonunu önlemek için her flakon eklenir ve kapaklar ve parafilm şişeleri ile mühürlenir. Şişeler, kullanılıncaya kadar -20 ° C derin dondurucuda saklanır.
- Kloroform 20 mg lipid bir kısım içeren tek bir flakon, her bir deney için kullanılır. Flakon içeriği, hiçbir solvent kalana kadar 1 saat boyunca azot gazı akışı ile kurutulur.
- Kurutulmuş lipidler, 1 ml 20 mM potasyum fosfat tamponu yeniden süspanse ~ 30 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör kullanarak (pH = 7.3). Bu çözüm, askıya lipid bulanık görünür ve konik bir alt 15-ml plastik bir tüpe aktarılır. Lipid başlangıçta yer alan boş cam şişe 1 ml fosfat tampon diğer kısım eklenir ve sonication tekrarlanır; çözüm daha sonra 15 mL aynı tüpe eklenir. Bu süreç, bir lipid konsantrasyonu 5 mg / ml bu hisse vezikül çözüm ile sonuçlanan tüp nihai hacmi, 4 mL kadar toplam 4 kez tekrarlanır.
- 4 mL hacimdeki lipid vezikül çözüm yerleştirilir sıcak (~ 30 ° C) su banyosu, ve 1 saat süreyle% 50 görev döngüsü ultrasonicator mikrotip kullanarak sonicated. Su banyosunda iki amacı vardır. İlk olarak, sonication süreci nedeniyle çok sıcak hale gelen lipid çözümü engeller. İkincisi, sıcak banyo sulu lipid çözüm sıcaklık sonication sırasında çift katlı faz geçiş sıcaklığı üzerinde kalmasını sağlar; DMPC için, bu geçiş sıcaklığı ~ 23 ° C
- Sonicated çözüm sonikatör ucundan enkaz kaldırmak ve bu filtre edilmiş solüsyon 37 geceleme dengelenmiş filtresi 0.22 mikron şırınga ° C geçirilir
2. İlk Floresan açılması Eğrisi için Numune Hazırlama
- 20 mM fosfat tamponu (pH 7.3), 10 M üre stok solüsyonu yapılır. Bu büyük miktarda üre çözümünde önemli bir hacim işgal eder, çünkü su katı (ve tersi) eklendi olması esastır. Bu üre çözeltisi temiz, boş şişe çözünenlerin ekleyerek ve amaçlanan nihai hacim su ekleyerek yapılabilir. Bu çözüm, bir su banyosu veya çözünen çözülür karıştırarak sıcak bir plaka üzerinde ısıtılması gerekebilir. Üre higroskopik ve bu nedenle, üre stok solüsyonu gerçek konsantrasyon, kırılma indisi kullanılarak tespit edilmelidir. 1
- 20 mM fosfat (pH 7.3) stok tampon çözeltisi yapılır.
- Bir stok solüsyonu protein hazırlanan gelişeceğini. Bu stok protein çözümü 8 M üre, 20 mM fosfat tamponu ~ 200 mcM protein konsantrasyonu olmalıdır.
- Floresan çalışmaları için örnekler şu şekilde hazırlanır. Uygun stok protein hacimleri (bölüm 2.3), lipid stok solüsyonu (5 mg / ml yağ, bölüm 1), hisse senedi 10 M üre çözeltisi (bölüm 2.1), ve stok fosfat tamponu (bölüm 2.2) ~ 4 içeren örnekler yapmak için bir araya mcM protein, 1 mg / ml yağ, 1 M artışlarla 0-8 M üre. Her numunenin toplam hacmi 200 mcL. Bir örnek tablo (Tablo 1) listeleri hacimleri 200 mcM stok protein solüsyonu kullanılarak gerekli olduğunu dahildir.
- Boş örnekleri bölüm 2.4 'te açıklandığı gibi yapılır, ancak, protein eklendi değildir. Diğer bileşenlerin konsantrasyonları bölüm 2.4 'te aynı şekilde protein yerine, 8 M üre çözeltisi 4 mcL eklenebilir. Bu boşlukları, saçılma ve protein floresans spektrumları görünen diğer arka plan sinyali çıkarmak için kullanılır.
- 2.4 ve 2.5 bölümleri örnekleri floresans spektrumları ölçümden önce tam katlama ve dengeleme sağlamak için en az 2 saat süreyle 37 ° C'de inkübe izin verilir.
3. Floresan Spectra ölçümü
Istikrarlı bir devlet flüorometre kullanılarak her örnek ve boş Triptofan floresan ölçülür. Floresans spektrumları tirozin kalıntılarının uyarma önlemek için 290 nm dalgaboyu ile kaydedilen ve 305 ila 500 nm taranmış olmalıdır. Tipik giriş ve çıkış bant geçiren 3 nm. Dalga boyu arttırma ve entegrasyon süresi, sinyal-gürültü oranı için optimize edilebilir. Dalga boyu arttırma ve entegrasyon zamanı için tipik değerler, 1 nm / adım ve sırasıyla 0.5 sn / adım,. Membran sıcaklığı çift katlı faz geçiş sıcaklığı üzerinde sadece içine genellikle kat sentetik lipidler proteinler. Bu nedenle, DMPC bu durumda, 30 numunenin sıcaklığı sabit tutulur ° C. 160 mcL kapasitesine sahip bir microvolume erimiş silika küvet bu eski kullanılmaktadırperiments.
4. İlk açılım Eğrisi açılması Membran Protein Gibbs Serbest Enerji ve Kestirim Üretimi
- Xy veri formu Floresans spektrumları Igor Pro, Matlab, Kökeni, veya Excel gibi yazılım yüklenir.
- Sinyal, üre ve lipid vezikül arka plan aşağıdaki yordamı kullanarak çıkarılır olmalıdır:
Protein, lipid veziküller ve spesifik konsantrasyon üre varlığını = ham floresans spektrumu Spektrum.
Spektrum B lipid veziküller ve aynı üre konsantrasyonu içeren ilgili boş örnek = ham floresans spektrumu bu kadar spektrumda; herhangi bir protein boş örnekleri.
Düzeltilmiş Spektrum = Spektrum A - C * spektrum B. C, tipik olarak 1.0 'e eşit bir skaler. Bazı durumlarda, C, çünkü neden saçılma konularda daha az ya da 1.0 'dan büyük veya ~ 305-320 nm bölgeye yakın çıkarma altında. - Dalga boyu, λ maksimum, maksimum floresans spektrumları her üre konsantrasyonu için düzeltilmiş tablolaştırılmıştır. Tamamen için tipik bir değeri katlanmış proteini ~ 330 nm ise membran protein 350 nm gözler önüne seriliyordu. Tablo dalga boylarında gelişeceğini nüfusu kesir λ max değeri ilişkilendirmek için 1.0 ila 0.0 aralığında λ maksimum değerleri (~ 330 ~ 350 nm) aralığında dönüştürme gelişeceğini fraksiyonu dönüştürülür. Örneğin, 330 nm λ max değeri 0.0 karşılık gelen, 350 nm 1.0 'e karşılık gelir ve 340 nm fraksiyonu açısından 0.5' e karşılık katlanmamış. Bu gelişeceğini protein fraksiyonu sonra üre konsantrasyonu karşı çizilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, üre konsantrasyonu, refraktif indeks ölçerek deneysel olarak tespit edilmelidir.
- Biz iki devlet bir protein bulunabilir varsayalım: katlanmış veya katlanmamış. Kesir arsa f gelişeceğini, üre konsantrasyonu, C, karşı denkleme uygun olabilir: 2
Katsayısı m denaturant konsantrasyon açısından serbest enerji değişim oranına karşılık gelir ve C m katlanmış nüfus gelişeceğini nüfus eşit olduğu orta noktası üre konsantrasyonu karşılık gelir. Bu değerler R (0.001987 kcal / mol • K) gaz yasası sabittir. Oturan en küçük kareler elde edilen veri analiz yazılımı tarafından uydurma değişkenleri, ve T (303 K) sıcaklık. - Fit elde edilen katsayılar üre yokluğunda ortaya konma Gibbs serbest enerji (kcal / mol) belirlemek için kullanılır:
.
. 5. Eğri açılması açılması, Gibbs Serbest Enerji Hassas Ölçüm için optimize edilmiştir.
- Yukarıda açıklanan açılımı eğrisi λ max en büyük değişiklik neden üre konsantrasyonlarının aralığı ortaya koymaktadır. Bu aralık, genellikle küçük ve unfolding çoğunluğu bu küçük aralık içinde gerçekleşir. Açılmadaki serbest enerji tam olarak belirlemek için, optimize edilmiş en küçük kareler montaj için gerekli birçok veri noktaları içeren bir arsa elde etmek için bu bölgede ek örnekler analiz edilir. Daha doğrusu, gözler önüne serilen eğrisi bu önemli bölgenin şeklini ortaya çıkarmak için 0.2 M artışlarla 4 M üre - Örneğin protein, 2 ve 4 M üre arasında gözler önüne serilir, örnekleri 2 içerdiğini yapılmış olabilir. Bu her üre konsantrasyonu boş spektrumları ölçmek için gerekli değildir; her ~ 0.5 M adım boş bir spektrumu ölçmek için yeterli.
- Orijinal gözler önüne serilen eğrisi elde edilen bu arsa elde açılmadaki serbest enerji biraz farklı, ama daha kesin bir değer yansıtır.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
| Örnek | son [Üre], M | stok protein (mcL) | stok lipid (mcL) | stok 10 M üre (mcL) | stok tampon (mcL) |
| 1 | ~ 0.16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
Tablo 1 floresan örnekleri yapmak için gereken stok çözelti hacmi
Şekil 1: tek bir triptofan kalıntı içeren ~ 5 mcM temsilcisi membran proteini Triptofan floresans spektrumları. (A) Ham protein floresans spektrumları (spektrumu 4.2 'den A), (B) boş Ham floresans spektrumları (4.2 spektrum B), (C) 4.2 spektrum düzeltildi.
Sayısız üre konsantrasyonları için Şekil 1 Şekil 2 membran protein triptofan floresans spektrumları düzeltildi.
Şekil 3 Şekil 2 veri elde 4.4 'denklemine uygun eğri açılması. Gibbs serbest enerjisi, bölüm 4.5 'e göre hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol triptofan artıkları içeren membran ile ilişkili proteinler ve peptitler eğriler açılmadaki nesil açıklamaktadır. Burada, triptofan floresan protein ve sentetik lipid veziküller takılı katlanmış, ya da çözelti içinde gelişeceğini olup olmadığını yansıttığı varsayılır. Gibi iki-devletli katlama ve serbest enerji denaturant konsantrasyonu ile lineer bağımlılığı gibi ek varsayımları, cari rapor yapılır; farklı denklemler bu varsayımların sonucu değiştirilmesi 2 deney protokolünde farklı spektroskopik gözlenebilirler yararlanmak için kolayca değiştirilebilir, bu tür dairesel dikroizm, emilim, ya da bir dışsal boya ile floresan, 3 yanı sıra jel elektroforezi 4. Ayrıca, anyonik lipidler gibi farklı denaturants guanidinium, asidik çözümler, ya da sıcaklık yanı sıra alternatif lipidler / veziküller gibi, büyük unilamellar veziküller veya miseller, 5,6 Son olarak, herhangi bir membran proteini, membran ilişkili peptid, ve geri dönüşümlü katlanabilir kriterlerini karşılayan çözünür protein / peptid protokolü uygulanabilir. yararlanılmış ve sergiler olabilir spektroskopik veya diğer bir farklı yapısal durumları gözlemlenebilir işaretleyici. Çözünür proteinler durumda, veziküller protokol açıkça atlanmıştır.
Açılmadaki Gibbs serbest enerji biyomoleküllerin stabilize noncovalent etkileşimleri içgörü sağlar. Laboratuvarda, biz farklı yerlerde tek triptofan artıkları içeren Dış Membran Protein (Ompa) mutantlar eğrileri unfolding ölçülen ve mutantlar beş yerli triptofan artıkları içeren yabani tip protein göre istikrarsızlaştırdı olduğunu bildirdi var. 7 Bu unfolding çalışmalar, titreşim spektroskopisi dahil olmak üzere diğer teknikleri, moleküler örnek ayrıntıları, hidrojen bağı ve istikrarın varyasyon temelini ikili etkileşimleri aydınlatmak için ile tamamlanmaktadır. Özetle, unfolding eğrileri oldukça basit bir tekniktir, membran ve çözünür proteinler protein katlanması ile ilgili termodinamik ortaya çıkarmak için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Pekin Wu Biz onu veri kullanımı için teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF KARİYER Jek için bir ödül tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P288 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285 |
References
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
