Иммуноцитохимическая: Человеческие нервные стволовые клетки

Summary

Иммуноцитохимическая представляет собой мощный метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интереса к культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, которые позволяют сохранить антител и получить максимальную отдачу от своих пятен.

Abstract

Иммуноцитохимическая это очень мощный и достаточно простой метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интересов, чаще всего белка в культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, что позволит исследователям сохранить первичные и вторичные антитела, получая высокое качество, воспроизводимые качественных и количественных данных из их окрашивания. Есть два аспекта этого протокола, который поможет сохранить объемы антитела необходимы для окрашивания. С одной стороны, клетки выращивают на небольших, круговые покровные, которые размещаются в лунках планшета для культуры ткани. После фиксации клеток на покровных могут быть удалены из скважин пластины. Для окрашивания антителами, покровное с клетками инвертируется на небольшую каплю раствора антител на парафильмом и покрыт второй кусок парафильмом для предотвращения высыхания. Используя этот метод, только ~ 25 мкл антител решения, необходимые для каждого покровное (или образец), чтобы быть окрашены. Этот протокол описывает иммуноокрашивания из человеческих стволовых нейронных / клеток-предшественников (hNSPCs), но может использоваться и для многих других типов клеток.

Protocol

День 1: Подготовка немецких Покровные стекла и посевные клетки

Примечание: немецкий покровные стекла часто предпочтительнее для культивирования первичных нервных стволовых клеток и нейронов. Мы используем следующий протокол очистки для улучшения адгезии клетки и распространяться. Позиция покровных в небольшой стойке, которая позволит жидкости доступ к обеим сторонам покровное. Во-первых, инкубировать покровных в 1% Liquinox в течение 10 минут, затем по 3 моет деионизированной водой. Убедитесь, что не мыльные пузыри остаются. Далее, инкубировать сползает в 1М HCl в течение 30 минут, затем по 3 моет деионизированной водой. Сухие покровные при 65 ° С в течение ночи. Передача покровные к стеклянной посуде и автоклав для стерилизации.

1. В капотом культуры ткани, место стерильную покровных в соответствующего размера и пластины.
   
   
2. Пальто покровные с ламинином для клеточной адгезии. Инкубируйте покровных в 10 мкг / мл поли D-лизин (PDL) в стерильной воде в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалить PDL и инкубировать покровных в 20 мкг / мл ламинин в EMEM течение 4 часов, или на ночь, на 37 ° C культуре ткани инкубатора.
   
   
   
   1. Примечание: Обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) и подсчет правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com / индекса / Details.stp? ID = 262 ), чтобы узнать, как ресуспендирования и считать hNSPCs.
      
      
3. Промыть ламинин покрытием покровные с PBS и семенных клеток в каждом покровное содержащих также в определенной плотности (мы часто используем начальной плотностью покрытия из 100,000-300,000 клеток / мл для клеток, что мы покрытий для иммунной).
   
   
4. Место пластины в 37 ° C культуре ткани инкубатора и позволяют клеткам придерживаться покровные (обычно не менее 4 часов не требуется).

День 2: фиксация, Permeabilizing, блокирование, и добавление Первичные антитела к Клетки

Примечание: Мы используем следующие 4% параформальдегида фиксатором сохранить морфологии клеток. Рецепт включает рН перехода, чтобы параформальдегида идти в раствор. Мы предпочитаем этот метод вместо использования тепла для растворения параформальдегида, поскольку более высокие температуры могут привести к образованию муравьиной кислоты, что может повысить фоне окрашивание при использовании флуоресценции. Некоторые компоненты фиксирующего помогают сохранить структуру цитоскелета (MgCl ₂ и EGTA), а другие помогают поддерживать общий морфологии (сахароза).

4% Параформальдегид Fixative для ячеек

Реагенты и действия:	Сумма на 100 мл фиксатора:
MilliQ воды	75 мл
Параформальдегид (весят в вытяжной шкаф)	4 г
10N NaOH, перемешать, добавить по капле, пока раствор очищает	по мере необходимости
10X PBS	10 мл
1M MgCl 2	0,5 мл
0,5 М EGTA	2 мл
Сахароза	4 г
6N соляной кислоты, титровать до рН 7,4	по мере необходимости
MilliQ воды	довести до 100 мл
Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели. Нагреть до 37 ° С до использования

1. На скамейке, удалить медиа и добавьте предварительно нагретого фиксатором. Инкубируйте в течение 5-15 минут (в зависимости от антигена быть обнаружены, мы обычно используем 10 минут). Выполнять это и следующие шаги при комнатной температуре.
   
   
2. Откажитесь от фиксатора в соответствующий контейнер, так как многие учреждения ручки параформальдегида как опасные отходы. Вымойте клетки 3 раза PBS, 5 минут каждый раз. При удалении решений от клеток, будьте осторожны, что всасывание не высыхает клеток. Кроме того, всегда есть следующее решение под рукой, чтобы добавить в клетках, прежде чем снимать пальто решение, которое их так, клетки не остается сухим.
   
   
3. Если антиген интересов внутри клетки, клеточная мембрана должна быть проницаемой, чтобы обеспечить въезд антитела. Для permeabilize клетки, используйте свежий 0,3% Тритон Х-100 решения в PBS. Внесите медленно, потому что Тритон вязкой, и убедитесь, что моющее средство полностью растворяется в PBS перед добавлением к клеткам. Permeabilize клетки в течение 5 минут с последующим промыванием клетки 3 раза PBS, 5 минут каждый раз.
   
   
4. Клетки должны быть обработаны с блокирующий агент для предотвращения неспецифического связывания антител. Мы используем бычьего сывороточного альбумина (БСА), как блокирующий агент. Блокирование решения осуществляется путем растворения 5% BSA в PBS (на рокера или ротатор, поскольку она требует времени для растворения), то фильтрация зольution с 0,45 мкм шприц фильтр. Блок клеток в 5% BSA / PBS решение в течение 1 часа при комнатной температуре.

Развести первичного антитела (которые, как мы надеемся, специфичные для белок), чтобы заранее определенной концентрации в 1% BSA / PBS (подготовлен разведении от 5% BSA / PBS). Место разбавленный первичного антитела (30 мкл на 25 мм покровным, 20 мкл на 18 мм покровным, 15 мкл на 12 мм покровным) на стеклянную пластинку покрыты парафильмом. Возьмите покровное с фиксированным клеток, инвертировать, что клетки лицом вниз, и положите ее на антитела решения, с тем, что клетки, находящиеся в контакте с антителом. Место второй полосе парафильмом по всей конструкции. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи.

День 3: стиральная, средняя инкубация антител, ядерной красителей и монтаж

1. Аккуратно снимите верхнюю полосу парафильмом и забрать покровное, инвертировать его, и поместить его обратно в тарелку с PBS в каждую лунку по моет так, чтобы клетки вверх.
   
   
2. Вымойте клетки 3 раза PBS, 5 минут каждый раз.
   
   
3. Выберите вторичными антителами, которые будет обнаруживать первичного антитела, например, если первичное антитело было сделано в кролика, вторичными антителами следует признать, кролика IgG. Позаботьтесь, чтобы также соответствовать антител изотипа (IgG, IgM, и т.д.). При использовании нескольких первичных антител, убедитесь, что они из разных видов или изотипов, и планируем обнаружить с помощью различных маркеров придается вторичных антител. Например, вы можете использовать анти-кролик вторичный связан с красным флуорофора с антимышиным вторичных связаны с зеленым флуорофора. Инкубируйте клетки на вторичном решение антитела разбавляют до нужной концентрации в 1% BSA в течение 2 часов в темном месте при комнатной температуре, используя ту же технику, как для первичного (шаги не показано на видео). Объем вторичных антител, необходимых для инкубации может быть немного больше, чем для первичного антитела, если вторичный хранится как глицерин (40 мкл на 25 мм покровным, 30 мкл на 18 мм покровным, 25 мкл на 12 мм покровным) .
   
   
   • Примечание: Если вы используете флуоресцентных молекул визуализировать вторичными антителами, выборка должна быть защищена от света когда-то вторичным антителом была добавлена. Инкубировать в темноте, или в фольге покрыты пластины.
     
     
4. Осторожно удалите покровные от парафильмом, как описано для первичного антитела. Вымойте клетки 2 раза с PBS, 5 минут каждый раз, после 1 минуты инкубации в 2 мкг / мл Hoechst ядерной пятно разводят в PBS (если ядерное контрастирующая предпочтительнее). Если Hoechst пятно старое и сигнал слишком тусклое, вы можете увеличить время инкубации и / или концентрации. После инкубации с Hoechst, мыть 1 раз в PBS в течение 5 минут.
   
   
5. Покровные стекла должны быть установлены на слайд с монтажными СМИ как визуализация на микроскоп. В тех случаях, флуоресцентные молекулы используется для визуализации вторичными антителами, монтаж средств массовой информации должны содержать агентов, чтобы минимизировать фотообесцвечивания. Мы используем Vectashield как монтаж средств массовой информации для флуоресценции. Место соответствующее снижение размера Vectashield на предметном стекле микроскопа (12 мкл на 25 мм покровным, 6 мкл на 18 мм покровным, 3 мкл на 12 мм покровным).
   
   
6. Тщательно подберите покровное и ополосните назад деионизированной водой для удаления солей (от PBS). Dab лишнюю воду на kimwipe или бумажным полотенцем, и лег на каплю Vectashield с ячейками вниз. Место на покровное под углом и позволяют спускаться медленно, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха. Этикетка слайд с указанием даты и любой образец информации.
   
   
7. Разрешить слайды с покровные высохнуть (в темноте), то всасывание лишнюю Vectashield со всего покровное края. Покровное края теперь могут быть закрыты с лаком для ногтей, если это необходимо (особенно полезно, если покровные будет рассматриваться на инвертированный микроскоп). Мы как правило, хранят наши слайды в морозильной камере -20 ° C.

Discussion

Этот протокол описывает процедуру иммуноокрашивания hNSPCs, что сводит к минимуму объем антител необходимо и дает надежные окрашивания клеток. Процедура, как описано, что лучше для внутриклеточных антигенов, но может быть изменен, чтобы пятно молекул клеточной поверхности, а также для усиления окраски цитоскелета.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous