Immunocytochemistry: मानव तंत्रिका स्टेम सेल

Summary

Immunocytochemistry उपस्थिति, subcellular स्थानीयकरण, और सभ्य कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम में सक्षम हो जाएगा कि एक एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए और एक धुंधला के सबसे अधिक से बाहर प्राप्त की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत

Abstract

Immunocytochemistry उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली और काफी सरल विधि, subcellular स्थानीयकरण, और ब्याज, सबसे अधिक संवर्धित कोशिकाओं में एक प्रोटीन के एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम है कि शोधकर्ताओं के संरक्षण के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी जबकि बाहर उनके धुंधला उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा हो रही है सक्षम हो जाएगा की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत इस प्रोटोकॉल के दो पहलुओं है कि धुंधला के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के संरक्षण में मदद कर रहे हैं. एक के लिए, कोशिकाओं के छोटे, परिपत्र coverslips कि एक ऊतक संस्कृति की थाली के कुओं में रखा जाता है पर बड़े हो रहे हैं. निर्धारण के बाद, coverslips पर कक्षों प्लेट के कुओं से हटाया जा सकता है है. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, कोशिकाओं के साथ coverslip parafilm पर एक एंटीबॉडी समाधान के छोटे ड्रॉप पर उलटा है और parafilm को सुखाने को रोकने का एक दूसरा टुकड़ा के साथ कवर किया जाता है. इस पद्धति का उपयोग करके, केवल ~ एंटीबॉडी समाधान के 25 μl प्रत्येक (या नमूना) coverslip के लिए दाग के लिए की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) के immunostaining का वर्णन है, लेकिन कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

दिन 1: जर्मन ग्लास Coverslips तैयारी और सीडिंग कक्ष

नोट: जर्मन कांच coverslips अक्सर संवर्धन प्राथमिक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के लिए बेहतर हैं . हम निम्नलिखित सफाई प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए कोशिका आसंजन और प्रसार में सुधार. एक छोटे से रैक में स्थिति coverslips कि coverslip के दोनों पक्षों के लिए तरल उपयोग की अनुमति होगी. पहले 10 मिनट के लिए 1% Liquinox में सेते coverslips, विआयनीकृत जल के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया. सुनिश्चित करें कि कोई भी साबुन के बुलबुले रहते. अगला, 30 मिनट के लिए 1M एचसीएल में सेते फिसल जाता है, विआयनीकृत जल के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया. पर सूखी coverslips 65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात. एक गिलास पकवान और बाँझ आटोक्लेव coverslips स्थानांतरण.

1. एक टिशू कल्चर हुड में, एक उचित आकार अच्छी तरह से थाली में बाँझ coverslips जगह है.
   
   
2. कोट coverslips laminin साथ कोशिका आसंजन के लिए. 10 μg / मिलीलीटर D-Lysine पाली (PDL) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बाँझ पानी में सेते हैं coverslips. 20 μg / 4 घंटे, या रात के लिए मिलीलीटर laminin EMEM में में एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में, PDL और सेते coverslips निकालें.
   
   
   
   1. नोट: passaging मानव तंत्रिका स्टेम सेल (लेख का संदर्भ लें http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) और गिनती मानव तंत्रिका स्टेम सेल (लेख http://www.jove.com / / सूचकांक Details.stp आईडी = 262 ) के लिए सीखने के लिए कैसे और resuspend hNSPCs गिनती.
      
      
3. प्रत्येक - coverslip युक्त एक निश्चित घनत्व (हम अक्सर कोशिकाओं है कि हम immunostaining के लिए चढ़ाना हैं के लिए एक 100,000-300,000 कोशिकाओं / एमएल के प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व का उपयोग) पर अच्छी तरह से में पीबीएस और बीज कोशिकाओं के साथ laminin लेपित coverslips कुल्ला.
   
   
4. प्लेस थाली में 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर और कोशिकाओं coverslips (आमतौर पर 4 घंटे की एक न्यूनतम आवश्यक है) का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.

दिन 2: Permeabilizing फिक्सिंग, अवरुद्ध है, और कक्ष के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ना

नोट: हम निम्नलिखित 4% paraformaldehyde लगानेवाला का उपयोग करने के लिए सेल आकारिकी की रक्षा . नुस्खा पीएच संक्रमण paraformaldehyde समाधान में जाने के लिए अनुमति भी शामिल है. हम इस विधि के बजाय गर्मी के उपयोग के paraformaldehyde भंग पसंद करते हैं क्योंकि उच्च तापमान चींटी एसिड, जो पृष्ठभूमि धुंधला वृद्धि हुई है जब प्रतिदीप्ति का उपयोग कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लगानेवाला मदद के कुछ घटक cytoskeletal संरचना ₍₂ MgCl और EGTA) की रक्षा करने के लिए, जबकि दूसरों को समग्र आकारिकी (sucrose) को बनाए रखने में मदद.

कक्ष के लिए 4% Paraformaldehyde लगानेवाला

अभिकर्मकों और कदम:	लगानेवाला के 100 एमएल के लिए राशि :
MilliQ पानी	75 मिलीलीटर
Paraformaldehyde (धूआं हुड में बाहर तौलना)	4 जी
10N NaOH हलचल, और dropwise जोड़ने जब तक समाधान को साफ करता है	के रूप में की जरूरत
10X पीबीएस	10 मिलीलीटर
1M 2 MgCl	0.5 मिलीलीटर
0.5 एम EGTA	2 मिलीलीटर
Sucrose	4 जी
6N एचसीएल, 7.4 पीएच के लिए टाइट्रेट	के रूप में की जरूरत
MilliQ पानी	100 मिलीलीटर के लिए लाने
4 ° C में 1 सप्ताह के लिए स्टोर. 37 तक गर्म डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें इससे पहले

1. पीठ पर, मीडिया हटायें और prewarmed लगानेवाला जोड़ें. 5-15 मिनट (पता लगाया जा प्रतिजन पर निर्भर करता है, हम आम तौर पर 10 मिनट का उपयोग करें) के लिए सेते हैं. इस और कमरे के तापमान पर निम्न चरणों का प्रदर्शन.
   
   
2. एक उपयुक्त कंटेनर में लगानेवाला त्यागें, के रूप में कई संस्थाओं को खतरनाक कचरे के रूप में paraformaldehyde संभाल. पीबीएस के साथ 3 बार कोशिकाओं, 5 मिनट हर बार धोएं. जब कोशिकाओं से समाधान हटाने, सावधान कि चूषण कोशिकाओं बाहर सूखा नहीं है. इसके अलावा, हमेशा हाथ पर अगले समाधान के लिए समाधान है कि कोट उन्हें इतना कोशिकाओं सूखी नहीं छोड़ रहे हैं को हटाने से पहले कोशिकाओं को जोड़ने का है.
   
   
3. यदि ब्याज की प्रतिजन सेल के अंदर है, कोशिका झिल्ली एंटीबॉडी के प्रवेश की अनुमति देने के लिए पारगम्य बनाया जाना चाहिए. कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, एक ताजा पीबीएस में 0.3% ट्राइटन समाधान X-100 का उपयोग करें. पिपेट धीरे क्योंकि ट्राइटन चिपचिपा है, और यकीन है कि डिटर्जेंट पूरी तरह से कोशिकाओं को जोड़ने से पहले पीबीएस में भंग. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं, कोशिकाओं Pbs, 5 मिनट प्रत्येक समय के साथ 3 बार धोने द्वारा पीछा किया Permeabilize.
   
   
4. कोशिकाओं गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन को रोकने के एक अवरुद्ध एजेंट के साथ इलाज किया जाना चाहिए. हम गोजातीय एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में सीरम albumin (BSA) का उपयोग करें. अवरुद्ध समाधान पीबीएस में 5% BSA भंग करके किया जाता है (एक झूली कुरसी या अंग को घुमानेवाली पेशी पर क्योंकि यह भंग करने का समय लगता है) तो प फ़िल्टरिंग0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ ution. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% समाधान / BSA पीबीएस में कोशिकाओं को ब्लॉक.

1% में एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता प्राथमिक एंटीबॉडी (जो उम्मीद है कि ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट है) पतला BSA / पीबीएस (5% / BSA पीबीएस से कमजोर पड़ने से तैयार). प्लेस एक गिलास parafilm के साथ कवर प्लेट पर प्राथमिक एंटीबॉडी (25 मिमी coverslip प्रति 30 μl, 18 मिमी coverslip प्रति 20 μl, 12 मिमी coverslip प्रति 15 μl) पतला. तय कोशिकाओं के साथ coverslip उठाओ, जैसे कि कोशिकाओं नीचे चेहरा, और यह एंटीबॉडी समाधान ताकि कोशिकाओं एंटीबॉडी के साथ संपर्क में हैं पर रखना पलटना. पूरे का निर्माण पर एक दूसरे parafilm पट्टी रखें. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.

3 दिन: धुलाई, माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, परमाणु दाग ​​और बढ़ते

1. शीर्ष parafilm पट्टी ध्यान हटाने और coverslip लेने, पलटना, और यह जगह पीबीएस के साथ थाली में वापस washes के लिए एक अच्छी तरह से में इतनी है कि कोशिकाओं का सामना कर रहे हैं.
   
   
2. पीबीएस के साथ 3 बार कोशिकाओं, 5 मिनट हर बार धोएं.
   
   
3. एक माध्यमिक एंटीबॉडी कि प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने, उदाहरण के लिए, अगर प्राथमिक एंटीबॉडी एक खरगोश में बनाया गया था, माध्यमिक एंटीबॉडी खरगोश आईजीजी पहचान करनी चाहिए चुनें. ख्याल रखना भी एंटीबॉडी निर्धारण मैच (आईजीजी, आईजीएम, आदि). कई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग अगर, सुनिश्चित करें कि वे विभिन्न प्रजातियों या isotypes से हैं, और माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़ी विभिन्न मार्करों के साथ का पता लगाने की योजना बनाते हैं. उदाहरण के लिए, आप एक हरे रंग की fluorophore के लिए एक विरोधी माउस माध्यमिक युग्मित के साथ एक विरोधी खरगोश एक लाल fluorophore माध्यमिक युग्मित इस्तेमाल कर सकते हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी अंधेरे में 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1% BSA में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए पतला समाधान में कोशिकाओं को सेते हैं, प्राथमिक के लिए के रूप में उसी तकनीक का उपयोग (वीडियो में दिखाया गया कदम नहीं है). माध्यमिक ऊष्मायन के लिए की जरूरत एंटीबॉडी की मात्रा प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए थोड़ा उस से भी बड़ा हो सकता है अगर माध्यमिक एक ग्लिसरॉल समाधान (25 मिमी coverslip प्रति 40 μl, 18 मिमी coverslip प्रति 30 μl, 12 मिमी coverslip प्रति 25 μl) के रूप में संग्रहीत हो सकता है .
   
   
   • नोट: यदि आप फ्लोरोसेंट अणु का उपयोग कर रहे हैं माध्यमिक एंटीबॉडी कल्पना, नमूना प्रकाश से संरक्षित किया जाना एक बार माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ा गया है की जरूरत है. अंधेरे में, या एक पन्नी कवर प्लेट में सेते हैं.
     
     
4. ध्यान प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए के रूप में वर्णित parafilm से coverslips हटा दें. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 2 बार, 5 मिनट हर बार, 2 μg / एमएल Hoechst परमाणु पीबीएस में पतला दाग (अगर एक परमाणु counterstain पसंद है) में 1 मिनट ऊष्मायन द्वारा बाद धो लें. यदि दाग Hoechst पुराना है और संकेत भी मंद है, तो आप ऊष्मायन समय और / या एकाग्रता में वृद्धि कर सकते हैं. Hoechst के साथ ऊष्मायन के बाद, Pbs के साथ 5 मिनट के लिए 1 बार धो लो.
   
   
5. coverslips दृश्य के लिए एक खुर्दबीन पर बढ़ते मीडिया के साथ एक स्लाइड पर घुड़सवार किया जाना चाहिए. जिन मामलों में एक फ्लोरोसेंट अणु माध्यमिक एंटीबॉडी के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है, मीडिया बढ़ते एजेंटों को रोकने के लिए photobleaching कम से कम करना चाहिए. हम प्रतिदीप्ति के लिए एक बढ़ते मीडिया के रूप में Vectashield का उपयोग करें. एक खुर्दबीन स्लाइड (25 मिमी coverslip प्रति 12 μl, 18 मिमी coverslip प्रति 6 μl, 12 मिमी coverslip प्रति 3 μl) पर एक Vectashield के उपयुक्त आकार ड्रॉप प्लेस.
   
   
6. ध्यान coverslip लेने और विआयनीकृत जल के साथ वापस कुल्ला लवण (पीबीएस से) को हटाने. एक kimwipe या कागज तौलिया पर से अतिरिक्त पानी बंद थपका, और नीचे का सामना करना पड़ रहा कोशिकाओं के साथ Vectashield के ड्रॉप पर रखना. पर एक कोण पर coverslip प्लेस और धीरे धीरे उतर फँसाने हवाई बुलबुले से बचने के अनुमति देते हैं. लेबल तारीख और किसी भी नमूने जानकारी के साथ स्लाइड.
   
   
7. Coverslips के साथ स्लाइड्स (अंधेरे में) शुष्क coverslip किनारे के आसपास से अधिक Vectashield बंद तो चूषण की अनुमति दें. coverslip किनारों अब नेल पॉलिश के साथ बंद किया जा सकता है, अगर वांछित (विशेष रूप से उपयोगी है अगर coverslips एक औंधा माइक्रोस्कोप पर देखा होगा). हम आम तौर पर एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में हमारे स्लाइड्स की दुकान.

Discussion

इस प्रोटोकॉल hNSPCs कि एंटीबॉडी की मात्रा आवश्यक minimizes और विश्वसनीय सेल धुंधला देता है के लिए एक immunostaining प्रक्रिया का वर्णन. प्रक्रिया के रूप में वर्णित intracellular प्रतिजनों के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन कोशिका की सतह अणुओं दाग या cytoskeleton की धुंधला बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous