Summary
免疫细胞化学是一个功能强大的方法来确定是否存在，亚细胞定位和兴趣在培养的细胞抗原的相对丰度。该协议提出了一个易于遵循的一系列步骤，使一个保护抗体染色。
Abstract
免疫细胞化学是一个非常强大的，相当简单的方法，确定存在的，亚细胞定位，利益，最常见的在培养细胞中的蛋白质，的抗原的相对丰度。此协议提供了一个易于遵循一系列的措施，将使研究人员能够节省小学和中学的抗体，而其染色质量高，重现性好定性和定量数据。这个协议有两个方面，以帮助保护抗体染色所需的量。其一，细胞是生长在小的，圆形盖玻片，放置在一个组织的文化板块井。盖玻片上的细胞固定后，可以删除从该板块的水井。抗体染色，与细胞的盖玻片上的封口膜的小滴的抗体溶液倒到第二件的封口膜覆盖，以防止干燥。使用这种方法，只〜25μl抗体溶液的需要为每个盖玻片（或样品）进行染色。本协议描述了人类神经干/前体细胞（hNSPCs）免疫，但可用于许多其他类型的细胞。
Protocol
第1天：准备德国盖玻片和种子细胞
注 ：德国盖玻片往往是最好培养初级的神经干细胞和神经元。我们使用下面的清洗方案，提高细胞的粘附和铺展。在一个很小的机架位置盖玻片盖玻片两侧，将允许液体访问。首先，在10分钟的1％Liquinox孵化盖玻片，其次是3用去离子水洗涤。确保没有肥皂泡保持。接下来，在1M盐酸，30分钟的孵育单用去离子水洗涤3。干盖玻片在65 ° C过夜。转移到一个玻璃盘和高压灭菌消毒的盖玻片。
- 在组织培养罩，放置在一个适当大小的孔板的无菌盖玻片。
- 大衣与层粘连蛋白细胞粘附的盖玻片。在10微克/毫升无菌水的聚D -赖氨酸（PDL）在室温下5分钟的孵育盖玻片。在20微克/毫升层粘连蛋白在EMEM，4小时，或隔夜取出盖玻片PDL和孵化，在37℃组织培养箱内培养。
- 注 ：请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com /指数/ Details.stp？ID = 262 ），以了解如何重悬并计数hNSPCs。
- 注 ：请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com /指数/ Details.stp？ID = 262 ），以了解如何重悬并计数hNSPCs。
- 到每个盖玻片含在一定的密度（我们经常使用的初始密度电镀电镀免疫的细胞，我们100,000-300,000细胞/ ml）冲洗层粘连蛋白涂层的盖玻片，用PBS和种子细胞。
- 广场板块在37 ° C组织文化的孵化器和允许细胞坚持以盖玻片（通常至少需要4小时）。
第2天：固定，Permeabilizing，阻止，并加入一抗细胞
请注意 ：我们使用以下的4％多聚甲醛固定液，以维持细胞的形态。配方包括pH值过渡到允许进入溶液中的多聚甲醛。我们喜欢这种方法，而不是热溶解多聚甲醛的使用，因为较高的温度可能会导致产生甲酸，这可能会增加背景用荧光染色时。固定液帮助一些组件，以维持细胞骨架结构（MgCl 2的和EGTA），而其他人的帮助，以保持整体形态（蔗糖）。
4％多聚甲醛为细胞固色剂
| 试剂和步骤： | 金额为100毫升的固定液： |
| MilliQ水 | 75毫升 |
| 多聚甲醛（权衡通风柜） | 4摹 |
| 10N氢氧化钠，搅拌，添加滴加，直至解决方案清除 | 根据需要 |
| 10X PBS | 10毫升 |
| 1M氯化镁2 | 0.5毫升 |
| 0.5中号EGTA | 2毫升 |
| 蔗糖 | 4摹 |
| 6N盐酸，pH值7.4滴定 | 根据需要 |
| MilliQ水 | 把100毫升 |
| 在4 ° C存储长达1个星期。加热至37 ° C，使用前 | |
- 在板凳上，消除媒体和添加预热固定液。孵育5-15分钟（取决于被检测到的抗原，我们通常使用10分钟）。执行此，在室温以下步骤。
- 丢弃到一个合适的容器，为许多机构处理危险废物的多聚甲醛固定液。洗净每一个细胞，用PBS 3次，5分钟时间。解决方案，从细胞中取出时，要小心，吸力不会干出细胞。此外，总有手头上的下一个解决方案，将之前删除的解决方案，大衣，使细胞不能离开干细胞。
- 如果抗原的兴趣是在细胞内，细胞膜必须渗透到允许的抗体进入。要通透细胞，使用一个全新的0.3％的Triton X - 100的PBS中的解决方案。移液器缓慢，因为Triton公司粘性，并确保洗涤剂完全溶解在PBS之前加入到细胞。通透细胞5分钟，洗涤细胞3次，用PBS，每次5分钟。
- 细胞必须被视为一个阻断剂，以防止非特异性抗体结合。我们使用牛血清白蛋白（BSA）作为阻断剂。阻塞的解决方案是由溶解到PBS 5％BSA（摇杆或肩，因为它需要时间解散），然后过滤溶胶ution用0.45μm的注射器过滤器。座在5％BSA / PBS液在室温下1小时的细胞。
淡化的主要抗体（这是希望感兴趣的蛋白质的具体），以预先确定的浓度在1％BSA / PBS（从5％BSA / PBS稀释配制）。稀释后用封口膜覆盖的玻璃板上的主要抗体（30μL，每25毫米盖玻片，18毫米盖玻片的20％微升，15％微升12毫米盖玻片）。拿起与固定细胞的盖玻片，翻转等，细胞面朝下，并奠定在抗体溶液，使细胞与抗体接触。放置在整个建造的第二的封口膜地带。孵育4℃过夜。
第3天：洗涤，二抗孵育，核染色和安装
- 小心取出顶部的封口膜带，拿起盖玻片，倒置，并把它在每口井洗到用PBS板，使细胞朝上。
- 洗净每一个细胞，用PBS 3次，5分钟时间。
- 选择一个次要的，能够检测到的主要抗体，例如，如果在兔的主要抗体，第二抗体应该认识到兔IgG抗体。小心也相匹配的抗体亚型（球蛋白IgG，IgM等）。如果使用多种抗体，确保他们是从不同的物种或亚型，并计划用不同的标记二级抗体检测。例如，你可以使用绿色荧光团的耦合抗鼠二抗兔二次再加一个红色荧光团。孵育细胞在二级抗体稀释至适当浓度在1％，2小时在黑暗中，在室温下BSA的解决方案，使用相同的技术为小学（步骤不显示视频）。孵化所需的二级抗体的抗体量可能比稍微大一点，如果辅助存储作为甘油溶液（40μL，每25毫米盖玻片，18毫米盖玻片的30％微升，25％微升12毫米盖玻片） 。
- 注 ：如果您使用的是荧光分子，以可视化的二次抗体，样品需要避光，一旦二级抗体已添加。在黑暗中孵育，或在金属箔覆盖板。
- 注 ：如果您使用的是荧光分子，以可视化的二次抗体，样品需要避光，一旦二级抗体已添加。在黑暗中孵育，或在金属箔覆盖板。
- 小心取出盖玻片抗体所述的封口膜。洗涤细胞2次，用PBS，每次5分钟，1分钟的潜伏期在2微克/毫升赫斯特核染色PBS稀释（如果核染液是首选）。如果赫斯特染色信号太暗，你可以增加孵育时间和/或浓度。用Hoechst孵育后，用PBS洗5分钟1次。
- 盖玻片应安装在与安装媒体上的显微镜可视化的幻灯片。在荧光分子是使用可视化的二次抗体的情况下，应包含安装媒体代理商，以尽量减少漂白。我们使用的荧光安装媒体Vectashield。载玻片（12μL盖玻片每25毫米，18毫米盖玻片的6％微升，3个12毫米的盖玻片液）Vectashield上放置适当大小的下降。
- 小心地拿起盖玻片，用去离子水冲洗回删除盐（从PBS）。民建联关闭kimwipe或纸巾上多余的水分，并奠定Vectashield朝下细胞下降。将盖玻片，在一个角度，并允许缓慢下降，以避免诱捕气泡。标签的日期和任何样品信息的幻灯片。
- 允许盖玻片幻灯片干（在黑暗中）从盖玻片边缘周围多余的Vectashield然后吸。盖玻片边缘，现在可以用指甲油密封，如果需要的话（尤其是有用的，如果盖玻片将在一个倒置显微镜观察）。我们通常储存在-20 ° C冰箱的幻灯片。
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Discussion
这一协议描述为hNSPCs的免疫程序，最大限度地减少了所需的抗体量，并提供可靠的的细胞染色。所描述的程序是最好的细胞内的抗原，但可以修改染色细胞表面的分子或增强细胞骨架的染色。
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Acknowledgments
作者要感谢在儿童医院，奥兰治县研究院提供封口膜染色技术的初步指导hNSPC文化和加里Bassell博士在埃默里大学的菲利普H ·施瓦茨博士国家人类神经干细胞资源。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma-Aldrich | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher Scientific | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
References
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
