Immunocytochemie: menselijke neurale stamcellen

Summary

Immunocytochemie is een krachtige methode om de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang in gekweekte cellen te bepalen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen serie van stappen die in staat zal stellen een om antistoffen te behouden en het meeste uit je vlekken krijgen.

Abstract

Immunocytochemie is een zeer krachtige en vrij eenvoudige methode voor het bepalen van de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang, meestal een eiwit, in gekweekte cellen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen reeks van stappen die in staat zal stellen onderzoekers aan primaire en secundaire antilichamen te besparen, terwijl het krijgen van hoge kwaliteit, reproduceerbare kwalitatieve en kwantitatieve gegevens uit hun vlekken. Er zijn twee aspecten van dit protocol die helpen om het volume van antilichaam nodig voor kleuring behouden. Voor een, zijn de cellen gekweekt op kleine, ronde dekglaasjes die zijn geplaatst in putjes van een weefselkweek plaat. Na fixatie, kunnen de cellen op de dekglaasjes verwijderd worden uit de putjes van de plaat. Voor antilichaam kleuring, is het dekglaasje met cellen omgekeerd op een kleine daling van antilichamen oplossing op parafilm en is bedekt met een tweede stuk van Parafilm om uitdroging te voorkomen. Met behulp van deze methode is slechts ~ 25 ui van antilichaam-oplossing die nodig is voor elke dekglaasje (of monster), te worden gemerkt. Dit protocol beschrijft immunokleuring van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), maar kan worden gebruikt voor vele andere celtypes.

Protocol

Dag 1: Voorbereiding van de Duitse dekglaasjes en zaaien Cellen

Let op: Duitse dekglaasjes worden vaak voorkeur voor het kweken van primaire neurale stamcellen en neuronen. We gebruiken de volgende schoonmaak protocol om celadhesie en de verspreiding te verbeteren. Positie coverslips in een klein rek dat vloeibare toegang tot beide zijden van het dekglaasje zal toestaan. De eerste, incubeer dekglaasjes in 1% Liquinox gedurende 10 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedemineraliseerd water. Zorg dat er geen zeepbellen blijven. Vervolgens glijdt incuberen in 1 M HCl gedurende 30 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedemineraliseerd water. Droog coverslips bij 65 ° C gedurende de nacht. Overdracht coverslips naar een glazen schaal en autoclaaf te steriliseren.

1. In een weefselkweek kap, plaats steriele dekglaasjes in een passende afmetingen goed plaat.
   
   
2. Coat coverslips met laminin voor celadhesie. Incubeer coverslips in 10 ug / ml poly D-Lysine (PDL) in steriel water gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de PDL en incubeer dekglaasjes in 20 ug / ml laminine in EMEM gedurende 4 uur of 's nachts, in een 37 ° C weefselkweek incubator.
   
   
   
   1. Opmerking: Raadpleeg de passage menselijke neurale stamcellen artikel ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) en de Counting menselijke neurale stamcellen artikel ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) om te leren hoe te mengen en te tellen hNSPCs.
      
      
3. Spoel laminine-beklede dekglaasjes met PBS en zaad cellen in elke dekglaasje-bevattende goed op een bepaalde dichtheid (we gebruiken vaak een eerste plating dichtheid van 100,000-300,000 cellen / ml voor cellen die we plating voor immunokleuring).
   
   
4. Laat de plaat in 37 ° C mogelijk weefselkweek incubator en cellen zich te houden aan dekglaasjes (meestal een minimum van 4 uur is vereist).

Dag 2: Fixing, Permeabilizing, blokkeren, en de toevoeging van primaire antilichaam aan cellen

Let op: We gebruiken de volgende 4% paraformaldehyde fixeermiddel naar cel morfologie behouden. Het recept bestaat uit een pH-overgang om de paraformaldehyde te gaan in de oplossing. We verkiezen deze methode in plaats van het gebruik van warmte om paraformaldehyde te ontbinden omdat hogere temperaturen kan leiden tot het genereren van mierenzuur, dat achtergrondkleuring kan toenemen bij het gebruik van fluorescentie. Sommige componenten van het fixatief helpen bij het ​​cytoskelet structuur (MgCl ₂ en EGTA) te behouden, terwijl anderen te helpen om de algemene morfologie (sucrose) te handhaven.

4% Paraformaldehyde Fixatief voor Cellen

Reagentia en stappen:	Bedrag voor 100 ml fixatief:
MilliQ water	75 ml
Paraformaldehyd (wegen in de zuurkast)	4 g
10N NaOH, roer en voeg druppelsgewijs tot oplossing wist	als dat nodig
10X PBS	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sucrose	4 g
6N HCl Titreer tot pH 7,4	als dat nodig
MilliQ water	brengen tot 100 ml
Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week. Warm tot 37 ° C voor gebruik

1. Op de bank, verwijdert u de media en voeg voorverwarmd fixeermiddel. Incubeer gedurende 5-15 minuten (afhankelijk van het antigeen te detecteren, gebruiken we meestal 10 minuten). Voer deze en de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
   
   
2. Gooi het fixeermiddel in een geschikt recipiënt, zoals veel instellingen hanteren paraformaldehyde als gevaarlijk afval. Was de cellen drie keer met PBS, 5 minuten per keer. Bij het verwijderen van oplossingen van de cellen, wees voorzichtig dat de zuigkracht niet uitdroogt de cellen. Ook, altijd de volgende oplossing bij de hand om de cellen toe te voegen voordat u de oplossing die jassen, zodat ze cellen niet verlaten om te drogen.
   
   
3. Als het antigeen van belang is in de cel, moet de cel membraan doorlaatbaar worden gemaakt om het invoeren van het antilichaam mogelijk te maken. Om permeabilize cellen, gebruik dan een verse 0,3% Triton X-100-oplossing in PBS. Pipet langzaam omdat Triton is viskeus, en zorg ervoor dat het wasmiddel volledig is opgelost in PBS voor het toevoegen aan cellen. Permeabilize cellen voor 5 minuten, gevolgd door het wassen van de cellen drie keer met PBS, 5 minuten per keer.
   
   
4. De cellen moeten worden behandeld met een blokkerende stof voor niet-specifieke binding van het antilichaam te voorkomen. We maken gebruik van bovine serum albumine (BSA) als een blokkerend middel. De blokkering oplossing is gemaakt door het oplossen van 5% BSA in PBS (op een rocker of een rotator omdat het tijd kost om op te lossen), dan filteren van de solution met een 0,45 pm spuitfilter. Blok cellen in 5% BSA / PBS-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

Verdun het primaire antilichaam (dat is hopelijk specifiek voor het eiwit van belang) voor een vooraf bepaalde concentratie in 1% BSA / PBS (bereid door verdunning van 5% BSA / PBS). Plaats verdunde primaire antilichaam (30 ul per 25 mm dekglaasje, 20 ul per 18 mm dekglaasje, 15 ul per 12 mm dekglaasje) op een glasplaat bedekt met Parafilm. Pak de dekglaasje met vaste cellen, omkeren zodanig dat de cellen naar beneden gezicht, en leg het over de antistof-oplossing, zodat de cellen in contact komen met het antilichaam. Plaats een tweede parafilm strip over de gehele constructie. Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht.

Dag 3: wassen, tweede antilichaam Incubatie, Nuclear Stain en montage

1. Verwijder voorzichtig de bovenste parafilm strip en pak het dekglaasje, keer het, en plaats het terug in de plaat met PBS in elk goed voor gewassen, zodat de cellen naar boven.
   
   
2. Was de cellen drie keer met PBS, 5 minuten per keer.
   
   
3. Kies een secundair antilichaam dat het primaire antilichaam zal detecteren, bijvoorbeeld als het primaire antilichaam werd gemaakt in een konijn, het secundaire antilichaam moeten erkennen konijn IgG. Zorg ervoor dat ook overeenkomen met het antilichaam isotype (IgG, IgM, etc). Bij gebruik van meerdere primaire antilichamen, zorg ervoor dat ze van verschillende soorten of isotypen, en van plan op te sporen met verschillende markers aan de secundaire antilichamen. Bijvoorbeeld, je zou een anti-konijn secundaire gekoppeld aan een rode fluorofoor te gebruiken met een anti-muis secundaire gekoppeld aan een groene fluorofoor. Incubeer cellen in het secundaire antilichaam-oplossing verdund tot een geschikte concentratie in 1% BSA gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur, met gebruikmaking van dezelfde techniek als voor primaire (stappen niet weergegeven in de video). Het volume van de secundaire antilichaam nodig is voor de incubatie kan iets groter zijn dan die voor de primaire antilichaam als de secundaire wordt opgeslagen als een glycerol-oplossing (40 ul per 25 mm dekglaasje, 30 ul per 18 mm dekglaasje, 25 ul per 12 mm dekglaasje) .
   
   
   • Opmerking: Als u gebruik maakt van fluorescerende moleculen aan het secundaire antilichaam te visualiseren, het monster moet worden beschermd tegen licht nadat het secundaire antilichaam is toegevoegd. Incubeer in het donker, of in een folie bedekt bord.
     
     
4. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de parafilm zoals beschreven voor het primaire antilichaam. Was cellen twee keer met PBS, 5 minuten per keer, gevolgd door een 1 minuut incubatie in 2 ug / ml Hoechst nucleaire vlek verdund in PBS (als er een nucleaire tegenkleuring heeft de voorkeur). Als het Hoechst vlek oud is en het signaal te zwak is, kunt u de verhoging van de incubatietijd en / of de concentratie. Na incubatie met Hoechst, was een keer met PBS gedurende 5 minuten.
   
   
5. De dekglaasjes moet worden gemonteerd op een dia met een montage van media voor visualisatie op een microscoop. In gevallen waarin een fluorescerend molecuul wordt gebruikt voor visualisatie van het secundaire antilichaam, moet de montage media bevatten agenten te minimaliseren fotobleken. We maken gebruik van Vectashield als een montage van media voor fluorescentie. Plaats een passende omvang daling van Vectashield op een microscoopglaasje (12 ul per 25 mm dekglaasje, 6 pl per 18 mm dekglaasje, 3 ul per 12 mm dekglaasje).
   
   
6. Voorzichtig pak de dekglaasje en spoel de achterzijde met gedemineraliseerd water om zouten (van de PBS) te verwijderen. Dep het overtollige water op een kimwipe of een papieren handdoek, en lag op de daling van Vectashield met cellen naar beneden. Plaats het dekglaasje op een hoek en laat langzaam af te dalen naar luchtbellen te voorkomen. Label de dia met de datum en een monster informatie.
   
   
7. Laat dia's met dekglaasjes te drogen (in het donker), dan zuig overtollige Vectashield van over de hele dekglaasje rand. De dekglaasje randen kunnen nu worden afgesloten met nagellak, indien gewenst (met name handig als dekglaasjes zal worden bekeken op een omgekeerde microscoop). We meestal slaan onze dia's in een -20 ° C vriezer.

Discussion

Dit protocol beschrijft een procedure voor immunokleuring hNSPCs dat het volume van antilichamen nodig minimaliseert en geeft betrouwbare cel vlekken. De procedure zoals beschreven is het beste voor intracellulaire antigenen, maar kan worden aangepast aan het celoppervlak moleculen vlek of vlekken van het cytoskelet te verbeteren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous