Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

Summary

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Abstract

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה מאוד פשוטה למדי לקביעת נוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן של עניין, בדרך כלל חלבון, בתאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו לחוקרים כדי לחסוך נוגדנים ראשוניים ומשניים תוך קבלת איכות גבוהה, איכותי לשחזור נתונים כמותיים מתוך מכתים שלהם. ישנם שני היבטים של פרוטוקול זה מסייע לשמר את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי מכתים. ראשית, התאים גדלים על, coverslips קטן עגול ממוקמים בארות צלחת בתרבית רקמה. לאחר קיבוע, התאים על coverslips ניתן להסיר את הבארות של הצלחת. עבור מכתים נוגדן, coverslip עם תאים הוא הפוך על ירידה קטנה של פתרון נוגדן על parafilm והוא מכוסה בחתיכת השני של parafilm כדי למנוע התייבשות. באמצעות שיטה זו, רק ~ 25 μl של פתרון נוגדן דרוש coverslip כל (או מדגם) להיות מוכתם. פרוטוקול זה מתאר immunostaining של האדם גזע / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), אך יכול לשמש הרבה סוגי תאים אחרים.

Protocol

יום 1: הכנת תאים Coverslips זכוכית הגרמנית מתזמן

הערה: coverslips זכוכית הגרמני לעיתים קרובות עדיף העיקרי culturing בתאי גזע עצביים ועל נוירונים. אנו משתמשים בפרוטוקול ניקוי הבאות כדי לשפר את הידבקות התא מתפשטת. מיקום coverslips במעמד קטן שיאפשר גישה נוזל על שני הצדדים של coverslip. ראשית, coverslips דגירה Liquinox ב 1% למשך 10 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. ודא כי אין בועות סבון להישאר. בשלב הבא, תלושי דגירה ב 1M HCl למשך 30 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. Coverslips יבש ב 65 ° C במשך הלילה. העברת coverslips על צלחת זכוכית החיטוי לעקר.

1. במנדף בתרבית רקמה, מקום סטרילי coverslips בצלחת גם בגודל הולם.
   
   
2. מעיל עם coverslips laminin עבור הידבקות התא. דגירה coverslips ב 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי D-ליזין (PDL) במים סטריליים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר coverslips PDL ו דגירה של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​laminin EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה.
   
   
   
   1. הערה: עיין Passaging האדם מאמר בתאי גזע עצביים ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ואת ספירת אדם בתאי גזע עצביים מאמר ( http://www.jove.com / ראשי / Details.stp? ID = 262 ) כדי ללמוד כיצד resuspend ולספור hNSPCs.
      
      
3. לשטוף laminin מצופה coverslips עם PBS ותאי הזרע לתוך coverslip המכילים כל טוב בצפיפות מסוים (לעתים קרובות אנו משתמשים צפיפות ציפוי ראשוני של 100,000-300,000 תאים / מ"ל ​​עבור תאים שאנחנו ציפוי עבור immunostaining).
   
   
4. צלחת מקום 37 ° C רקמה תרבות החממה ולאפשר לתאים לדבוק coverslips (בדרך כלל מינימום של 4 שעות נדרש).

יום 2: תיקון, Permeabilizing, חסימה, ואת הוספת נוגדן ראשוני לתאי

הערה: אנו משתמשים מקבע הבאים paraformaldehyde 4% כדי לשמור על מורפולוגיה התא. המתכון כולל המעבר pH לאפשר paraformaldehyde להיכנס פתרון. אנחנו מעדיפים את השיטה ולא את השימוש של חום לפזר paraformaldehyde בגלל טמפרטורות גבוהות יותר יכול להוביל לדור של חומצה פורמית, אשר יכול להגביר מכתים הרקע בעת שימוש פלואורסצנטי. רכיבים מסוימים של מקבע לעזור לשמר את מבנה cytoskeletal (MgCl ₂ ו EGTA), בעוד אחרים לעזור לשמור על המורפולוגיה הכללית (סוכרוז).

Paraformaldehyde מקבע 4% עבור תאים

ריאגנטים את הפעולות הבאות:	עבור סכום של 100 מ"ל מקבע:
MilliQ מים	75 מ"ל
Paraformaldehyde (שוקל לצאת למכסה המנוע קטר)	4 גרם
10N NaOH, מערבבים ומוסיפים dropwise עד פתרון מנקה	לפי הצורך
10X PBS	10 מ"ל
1M MgCl 2	0.5 מ"ל
0.5 מ EGTA	2 מ"ל
סוכרוז	4 גרם
HCl 6N, לכיל ל-pH 7.4	לפי הצורך
MilliQ מים	מביאים 100 מ"ל
חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1. חם על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש

1. על הספסל, הסר את המדיה להוסיף מקבע prewarmed. דגירה של 5-15 דקות (תלוי אנטיגן כדי להיות מזוהים, אנחנו בדרך כלל משתמשים 10 דקות). בצע זאת בשלבים הבאים בטמפרטורת החדר.
   
   
2. בטל מקבע לתוך מיכל מתאים, כמו מוסדות רבים להתמודד paraformaldehyde כמו פסולת מסוכנת. שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. בעת הסרת פתרונות מן התאים, להיזהר כי היניקה לא לייבש את התאים. כמו כן, תמיד יש את הפתרון הבא מצד להוסיף תאים לפני הסרת פתרון מעילים אותם כל כך התאים לא נותר יבש.
   
   
3. אם אנטיגן של הריבית בתוך התא, קרום התא חייב להיעשות חדיר כדי לאפשר כניסה של הנוגדן. כדי permeabilize תאים, השתמש טריים 0.3% Triton X-100 פתרון PBS. פיפטה לאט כי טריטון הוא צמיג, ולוודא דטרגנט הוא נמס לגמרי לפני שמוסיפים לתאים PBS. Permeabilize תאים במשך 5 דקות, ואחריו כביסה התאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם.
   
   
4. התאים חייבים להיות מטופלים עם סוכן חסימה כדי למנוע אי - ספציפי המחייב של הנוגדן. אנו משתמשים אלבומין בסרום שור (BSA) כסוכן חסימה. הפתרון חוסם מיוצר על ידי המסת BSA 5% לתוך PBS (על כסא נדנדה או הכתף כי זה לוקח זמן לפרק) ואז סינון סולution עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. בלוק תאים פתרון BSA / PBS 5% למשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.

לדלל את הנוגדן הראשוני (בתקווה שהוא ספציפי לחלבון ריבית) לריכוז שנקבע מראש 1% BSA / PBS (שהוכן על ידי דילול מ -5% BSA / PBS). המקום בדילול נוגדן ראשוני (30 μl לכל coverslip 25 מ"מ, 20 μl לכל coverslip 18 מ"מ, 15 μl לכל coverslip 12 מ"מ) על צלחת זכוכית מכוסה parafilm. תרימי את coverslip עם תאים קבוע, להפוך כך התאים עם הפנים כלפי מטה, ולהניח אותה על הפתרון נוגדן כך התאים באים במגע עם הנוגדן. מניחים רצועה parafilm השני מעל לבנות את כולו. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

יום 3: כביסה, דגירה נוגדן משנית, כתמים גרעיני הרכבה

1. הסר בזהירות את רצועת parafilm העליון להרים את coverslip, להפוך אותו, לשים אותו בחזרה לתוך הצלחת עם PBS היטב כל אחד שוטף כך התאים כלפי מעלה.
   
   
2. שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם.
   
   
3. בחר נוגדנים משני יאתר את הנוגדן הראשוני, למשל, אם את הנוגדן הראשוני נעשה ארנב, את הנוגדן משני להכיר ארנב IgG. תשמרי על עצמך גם להתאים את אלוטיפ נוגדנים (IgG, IgM, וכו '). אם באמצעות נוגדנים העיקרי מרובים, לוודא שהם ממינים או isotypes שונים, תוכנית לזהות עם סמנים שונים המחוברים נוגדנים משני. לדוגמה, תוכל להשתמש בשילוב נגד ארנב משנית fluorophore אדום בשילוב עם העכבר אנטי משנית fluorophore ירוק. דגירה תאים הפתרון נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים BSA 1% למשך 2 שעות בחושך בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בטכניקה זהה הראשי (לא צעדים המוצג בסרטון). נפח נוגדנים משני הדרושים הדגירה עלול להיות מעט גדול יותר מזה של הנוגדן הראשוני אם המשני מאוחסן כפתרון גליצרול (40 μl לכל coverslip 25 מ"מ, 30 μl לכל coverslip 18 מ"מ, 25 μl לכל coverslip 12 מ"מ) .
   
   
   • הערה: אם אתה משתמש מולקולות ניאון כדי להמחיש את הנוגדן משנית, המדגם צריך להיות מוגן מפני אור פעם את הנוגדן משני שנוסף לו. דגירה בחושך, או צלחת מכוסה בנייר כסף.
     
     
4. הסר בזהירות את coverslips מ parafilm כמתואר עבור נוגדן הראשוני. שטפו תאים 2 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם, ואחריו הדגירה 1 דקה 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​Hoechst גרעיני כתם מדולל PBS (אם counterstain גרעינית היא המועדפת). אם הכתם הוא Hoechst ישנים האות חלש מדי, אתה יכול להגדיל את זמן הדגירה ו / או ריכוז. לאחר הדגרה עם Hoechst, לשטוף פעם 1 עם PBS במשך 5 דקות.
   
   
5. Coverslips צריך להיות מותקן על שקופית עם התקשורת הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ. במקרים בהם מולקולה ניאון משמש להדמיה של נוגדן המשני, התקשורת הרכבה צריכה להכיל סוכני למזער photobleaching. אנו משתמשים Vectashield כאמצעי תקשורת הרכבה פלואורסצנטי. הצב ירידה בגודל המתאים של Vectashield בשקופית מיקרוסקופ (12 μl לכל coverslip 25 מ"מ, 6 μl לכל coverslip 18 מ"מ, 3 μl לכל coverslip 12 מ"מ).
   
   
6. בזהירות להרים את coverslip ולשטוף האחורי עם מים deionized להסיר מלחים (מן PBS). טובלים את המים העודפים על kimwipe או מגבת נייר, ומניחים על ירידה של Vectashield עם תאים כלפי מטה. מניחים את coverslip על בזווית ולאפשר לרדת לאט, כדי למנוע בועות אוויר השמנה. לייבל את השקופית עם התאריך וכל מידע המדגם.
   
   
7. אפשר שקופיות עם coverslips להתייבש (בחושך) יניקה אז את Vectashield עודף מסביב לקצה coverslip. הקצוות coverslip כעת ניתן חתום עם לק, אם תרצה בכך (שימושי במיוחד אם coverslips יראו על מיקרוסקופ הפוך). אנחנו בדרך כלל לאחסן שקופיות שלנו למקפיא -20 מעלות צלזיוס.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הליך immunostaining עבור hNSPCs זה ממזער את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי ונותנת מכתים תא אמין. ההליך המתואר הוא הטוב ביותר עבור אנטיגנים תאיים, אך ניתן לשנות כתם פני התא מולקולות או כדי לשפר כתמים של cytoskeleton.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous