Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Summary

Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.

Abstract

Ein zentrales Problem in der Entwicklungsbiologie ist es, den Ursprung der unzähligen Zelltypen, die in Wirbeltieren wie sie sich aus undifferenzierten Vorstufen entstehen abzuleiten. Die Forscher haben verschiedene Methoden der Linie Kennzeichnung, wie DiI Markierung ¹ und Druck Injektion nachvollziehbar Enzyme ² bis festzustellen Zellschicksal in späteren Stadien der Entwicklung in Modellsystemen eingesetzt. Die ersten Schicksal Karten im Zebrafisch (Danio rerio) wurden von iontophoretischen Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, wie Rhodamin Dextran montiert, in einzelne Zellen in diskreten Regionen des Embryos und Tracing der markierten Zelle das Schicksal im Laufe der Zeit ^3-5. Während wirksam sind diese Methoden technisch anspruchsvoll und erfordern eine spezielle Ausrüstung nicht allgemein in Zebrafisch-Forschungsgruppen gefunden. In jüngster Zeit sind photoconvertable fluoreszierende Proteine, wie Eos und Kaede, die irreversibel von grünen Schalter auf rote Fluoreszenz bei UV-Licht ausgesetzt, sehen verstärkten Einsatz im Zebrafisch ^6-8. Die optische Klarheit der Zebrafisch-Embryos und die relative Leichtigkeit der Transgenese haben diese besonders attraktiv Werkzeuge für die Linie Etikettierung gemacht und die Migration von Zellen in vivo ⁷ zu beobachten. Trotz ihrer Nützlichkeit, haben diese Proteine ​​auch einige Nachteile auf Farbstoff-vermittelte Linie Kennzeichnung Methoden verglichen. Der wichtigste ist die Schwierigkeit, die wir bei der Beschaffung von hoher 3-D-Auflösung während Photokonversion dieser Proteine ​​gefunden haben. In diesem Licht, vielleicht die beste Kombination aus Auflösung und Benutzerfreundlichkeit für Linie Kennzeichnung im Zebrafisch nutzt Käfig Fluorescein Dextran, einem Fluoreszenzfarbstoff, die zu einer Löschung Gruppe gebunden ist, dass Masken seine Fluoreszenz ^9. Der Farbstoff kann dann "uncaged" (veröffentlicht von der Löschung Gruppe) innerhalb einer bestimmten Zelle mit UV-Licht von einem Laser-oder Quecksilber-Lampe, so dass Visualisierung der Fluoreszenz-oder Immundetektion. Im Gegensatz zu iontophoretischen Methoden können caged Fluorescein mit Standard-Einspritzvorrichtungen injiziert werden und uncaged mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Lochkamera ¹⁰ ausgestattet. Darüber hinaus erkennen Antikörper gegen Fluorescein nur die uncaged Form, und das Epitop überlebt Fixierung gut ^11. Schließlich kann im Käfig Fluorescein mit einer sehr hohen 3-D-Auflösung aktiviert werden, besonders dann, wenn der Zwei-Photonen-Mikroskopie ^12,13 eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Linie Kennzeichnung von caged Fluorescein und Laser Uncaging. Subsequenctly ist uncaged Fluorescein gleichzeitig mit anderen Epitope wie GFP durch Markierung mit Antikörpern nachgewiesen.

Protocol

1. Synthese von Fluorescein Dextran Caged

1. Messen Sie 3,5 bis 4 mg Aminodextran und fügen in die Invitrogen bereitgestellte getönte Röhre mit 1 mg CMNB-Käfig Fluorescein SE. In unseren Händen dieses Verhältnis ergibt eine durchschnittliche Belastung von ~ 2,5 Farbstoffmoleküle pro Dextran.
2. Add 500 ul von 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ (Natriumborat) Puffer, um das Rohr.
3. Cap und Vortex für 30 Sekunden, um die Aminodextran und eingesperrt Fluorescein aufzulösen.
4. Lassen Sie reagieren über Nacht auf einem Vortex-Mischer.
5. Twist off unten Schließung auf einer Zeba Spin-Säule und lösen Sie die Kappe. Markieren Sie einen Punkt auf der Säule mit einem Filzstift. Legen Spalte in einer 15-mL konischen Rohr.
6. Zentrifugation bei 1000 xg für 2 min mit dem Punkt vor der Mitte des Rotors. Verwenden Sie die Spalte sofort nach dem Verdichten.
7. Ort verdichtet Spalte in eine neue 15-mL konischen Rohr.
8. Pool Reaktionsgemisch und Transfer zum Zentrum des verdichteten Spalte Harzbett. Wieder aufsetzen.
9. Zentrifugation bei 1000 xg für 2 min mit dem Punkt vor der Mitte des Rotors. Nach dem Spin, wird dem Eluenten und der Kopf der Kolonne in etwa die gleichen Schatten in der Farbe gelb.
10. Übertragen Sie die gelbe Eluent (~ 350 mL) zu einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß.
11. Lyophilisieren zur Trockne Speedvac. Decken Sie die Speedvac mit Folie.
12. Re-suspend die daraus resultierenden ~ 2-3 mg hellgelber Schaum im Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1% w / v.
13. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 ° C in Folie abgedeckten Rohre. Es ist eine gute Idee, Aliquot der Dextranlösung, um sich wiederholende Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

2. Die Injektion von Caged Fluorescein Dextran In Zebrafisch-Embryos

1. Verdünnen Sie 1% w / v Bestand Käfig Fluorescein Dextran 1:5 oder 1:10 in 0,2 M KCl.
2. Inject 0,5 - 1.0nL der Käfig Fluorescein-Lösung in den Dotter von einer Zelle Embryonen mit einem Injektor. Nach der Injektion muss Kupplungen von Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C gehalten werden, um unspezifische Uncaging reduzieren.
3. Entfernen Sie manuell Chorion aus Embryonen.
4. Anesthetize Embryonen in 4% Tricaine.
5. Embryonen werden in 0,8% Agarose in 35mmx10mm Petrischale angebracht werden, dann mit Ei mit Wasser bedeckt.
6. Äquilibrieren geschmolzener Agarose in 50 ° C Hitze-Block für mindestens 15 Minuten.
7. Mit einer Glaspipette, Ausarbeitung eines Embryos in einer minimalen Menge Wasser und geben es in die Agarose. Hinweis: Es ist wichtig, um das Rohr von Agarose in Ihrer Hand kühl für ca. 30 Sekunden vor der Inbetriebnahme des Embryos in die Röhre zu vermeiden Tötung des Embryos.
8. Pipette der Embryo aus der Tube, zusammen mit etwa 50 ul Agarose und werfen den Inhalt auf der Mitte der Petrischale.
9. Schnell orientieren des Embryos mit einem Kunststoff-Faden mit den Zellen zu uncaged nach oben zeigt. Hinweis: Die Agarose mit kühlen schnell so voreilig sein mit der Ausrichtung des Embryos. Embryonen können beschädigt werden, wenn manipuliert, nachdem die Agarose erstarrt sein.
10. Lassen Sie die Agarose vollständig erstarren (das dauert ein paar Minuten) und füllen die Schüssel zu zwei Dritteln gefüllt mit Ei Wasser mit 4% Tricaine und 0,003% PTU.

3. Laser Uncaging von Fluorescein Dextran

1. Das Mikroskop für Uncaging verwendet muss einen 40X Wasserimmersionsobjektiv.
2. Wir verwenden eine Photonics Instruments Laser mit der 365 nm Farbstoff-Zelle und die 70% / 30% aufgeteilt dichroitischen Spiegel.
3. Vor Uncaging, muss der Laser gemacht parfokal mit dem Ziel und abgeschwächt auf die entsprechende Leistung sein.
4. Zur Fokussierung des Lasers, statt eines gespiegelten Objektträger unter das Ziel und Schwerpunkt der Ziel bis Kratzer in der Folie sichtbar sind.
5. Passen Laser Abschwächer bis der Laser eine deutlich sichtbare Kratzer in den Spiegel mit einem einzigen Impuls erzeugen können.
6. Passen Sie das Ziel konzentrieren rauf und runter. Wenn der Laser einen Kratzer produzieren kann, wenn das Ziel ist unscharf, passen Sie die Laserfokus ¼ Drehung nach oben oder unten. Wiederholen, bis der Laser die Spiegel nur, wenn das Ziel fokussiert ist verkratzen können.
7. Ort montiert Embryo unter dem Objektiv und Fokussierung auf den Bereich um uncaged werden.
8. Um Uncage, auf eine Zelle von Interesse konzentrieren und Puls ist 10-20 mal bei 2-3 Hz.
9. Nach Uncaging, kostenlos den Embryo durch Schälen Agarose entfernt mit einer Pinzette und setzen sie in Ei-Wasser mit 0,003% PTU. Lassen Embryonen in einer lichtdichten Box zu entwickeln, bis sie fixiert sind.

4. Antikörper Markierung und Detektion von Uncaged Fluorescein Dextran

1. Fix Embryonen in Ab Fixativ (4% Paraformaldehyd, 0,3 CaCl _2, 8% Saccharose, Buffered 1X Phosphat Saline, pH 7,3) für zwei Minuten vor vier Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (O / N) bei 4 ° C. Keep Embryonen in einem lichtdichten Kasten oder Folie eingeschweißt Rohr für die Etikettierung Schritte.
2. Entfernen Fixiermittel und ersetzen mit 100% MeOH, lassen für 10 Minuten bei RT, entfernen MeOH und Replace mit frischen 100% MeOH.
3. Shop in MeOH bei -20 ° C für mindestens 30 Minuten. Hinweis: Sie können in MeOH für bis zu zwei Wochen lagern, bevor Epitope zu beeinträchtigen beginnen.
4. Rehydrieren Embryonen mit 5 Minuten Wäschen bei RT von 75% MeOH/1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), dann 50% MeOH/50% 1XPBTw, dann 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Dreimal für 5 Minuten in 1XPBSTw.
6. Wenn Embryonen> 24 Stunden alt sind, permiabilize Embryonen mit 10 pg / ml Proteinase K in 1XPBSTw. Permiabilization ist abhängig von der Bühne. Fünf Minuten in Proteinase K ist ausreichend, wenn die Embryonen zwischen 24 und 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) sind. Mehr Zeit kann, wenn für ältere Larven erforderlich. Re-fix in Ab Fixativ für 20 Minuten bei RT
7. Wash fünf Mal für 5 Minuten in 1XPBSTw bei RT.
8. Inkubieren in Block-Lösung (1XPBS, 0,1% Triton x100, 10% Schafserum, 10% Rinderserumalbumin, 1% Dimethylsulfoxid) für 1-2 Stunden bei RT.
9. Verdünnen primären Antikörper (Anti-Fluorescein sowie Antikörper gegen Zelltyp spezifische Marker) in Blocking-Lösung.
10. Inkubieren Embryonen O / N bei 4 ° C in Lösung mit primären Antikörpern.
11. Wash viermal für 20 Minuten in 1XPhosphate Kochsalzlösung mit 0,1% Triton x100 (PBSTx) bei RT.
12. Verdünnen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (in der Regel 1:300) in Blocking-Lösung.
13. Inkubieren O / N bei 4 ° C in Lösung mit Sekundärantikörper.
14. Wash viermal für 20 Minuten in 1XPBSTx bei RT.
15. Klare Embryonen in 50% glycerol/50% 1XPBS für mindestens zwei Stunden bei RT, dann entfernen Glycerin / PBS-Mischung und 100% Glycerin und stehen lassen O / N bei 4 ° C.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Nach Immunomarkierung, sollte es eine angereicherte Bereich der Färbung in den Zellen, die uncaged (Figure.1) waren. Es ist nicht ungewöhnlich, dass ein relativ hohes Signal-Rausch-Verhältnis sehen in> 48 Stunden alten Zebrafisch, durch spontane Uncaging der Fluorescein.

Abbildung 1. Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch Zirbeldrüse komplex. Bei 24 HPF, einen Teil der vorderen Epiphyse anlage, durch foxd3 angegeben:. GFP-Expression, uncaged wurde mit UV-Laserpulsen A) Durch 48hpf, rief einer linksseitigen Zellklumpen die parapineal (roter Kreis) hat von der uncaged entstanden Domain (weißer Kreis). B) Uncaged Fluorescein-Signal wird in der parapineal (roter Kreis angereichert) und das Pinealorgan (weißer Kreis).

Discussion

Wie beschrieben, stellt dieses Protokoll eine relativ schnelle Linie Kennzeichnung Methode in Zebrafisch, dass bei den üblicherweise verwendeten Techniken der Mikroinjektion, Mikroskopie und Immunfluoreszenz gebaut wird. Wir haben festgestellt, dass Laser auf die effizienteste und kostengünstigste Weg, um Fluorescein in einer lokalisierten Mode Uncage werden Uncaging. Diese Methode könnte auf Linie Etikett mit experimentellen Endpunkte werden so spät wie 4 dpf verwendet. Doch wie sich Zellen teilen, die caged-Fluorescein-Konzentration pro Zelle schließlich sinkt jenseits nachweisbaren Mengen. Darüber hinaus gibt es Berichte von spontanen, nicht-spezifische Uncaging von Fluorescein in Zebrafischlarven ^{11 vor.} Als solcher Nachweis uncaged Fluorescein ist am effektivsten in der frühen Larvenstadium (48-72 hpf) oder früher.

Unsere bevorzugten Uncaging Methode wird durch Verwendung eines gepulsten Stickstoff-Laser. Diese werden üblicherweise für die Zell-Ablationen Experimenten verwendet und sind ausreichend genau, um singe Zellen oder kleine Gruppen von Zellen ^11-12 Uncage. Allerdings kann Uncaging auch unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops werden; Zwei-Photonen-konfokale Mikroskope verwendet worden, um sehr genaue Uncaging ^{12 zu} erreichen. Am anderen Ende des Spektrums, wenn Präzision nicht erforderlich ist dann ein Laser ist entbehrlich. Ein epifluoreszenten Mikroskop mit einem DAPI-Filter gesetzt ausgestattet sind, können verwendet werden, um durch ein kleines Loch ¹¹ Uncage werden.

Wir haben die Detektion von uncaged Fluorescein mit einem primären Antikörper und fluoreszierende sekundäre Antikörper, der an einer roten oder weit roten Wellenlängenbereich (zB Alexa 633) am besten unseren Anforderungen emittiert gefunden. Dies erlaubt uns, uncaged Fluorescein von GFP durch ein Transgen (Abbildung 1) zum Ausdruck zu unterscheiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3