Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

Summary

פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.

Abstract

הבעיה המרכזית בביולוגיה התפתחותית היא להסיק את מקורם של סוגי התאים הרבים המצויים חוליות כפי שהם נובעים מבשרי מובחן. חוקרים בשיטות שונות של תיוג השושלת, כגון תיוג DiI ¹ ו הזרקה בלחץ של אנזימים למעקב ² לגורל התא לברר בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות במערכות מודל. מפות גורל הראשון דג הזברה (Danio rerio) הורכבו על ידי הזרקת iontophoretic של צבעי ניאון, כגון rhodamine dextran, לתוך תאים בודדים באזורים נפרדים של העובר וכן מעקב גורל התא מסומן לאורך זמן ^3-5. בעוד יעיל, שיטות אלו תובענית מבחינה טכנית דורשים ציוד מיוחד ולא נפוץ למצוא דג הזברה מעבדות. לאחרונה, חלבוני ניאון photoconvertable, כגון Eos ו קאךה, אשר באופן בלתי הפיך לעבור מירוק פלואורסצנטי אדום בעת חשיפה לאור אולטרה סגול, רואים שימוש מוגבר דג הזברה ^6-8. בהירות אופטית של העובר דג הזברה ואת הקלות היחסית של transgenesis הפכו כלים אלה אטרקטיבי במיוחד עבור תיוג השושלת כדי לבחון את ההגירה של תאים in vivo ^7. למרות השירות שלהם, חלבונים אלה יש כמה חסרונות לעומת לצבוע בתיווך שיטות תיוג השושלת. החשוב ביותר הוא הקושי שמצאנו בהשגת ברזולוציה גבוהה 3-D במהלך photoconversion של החלבונים האלה. לאור זאת, אולי את השילוב הטוב ביותר של ההחלטה וקלות השימוש עבור תיוג השושלת של דג הזברה עושה שימוש בכלוב והעמסת dextran, צבע פלואורסצנטי כי הוא מחויב לקבוצה מרווה כי מסכות ⁹ הקרינה שלה. לצבוע אז יכול להיות "שברחה מכלוב" (שוחרר מהקבוצה מרווה) בתוך תא ספציפי באמצעות אור UV ממנורת לייזר או כספית, המאפשר ויזואליזציה של הקרינה שלה או immunodetection. שלא כמו שיטות iontophoretic, והעמסת בכלוב ניתן להזריק עם מנגנוני זריקה סטנדרטיים שברחה מכלוב עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד חריר ^10. בנוסף, נוגדנים נגד והעמסת לזהות רק את הטופס שברחה מכלוב, ו epitope שורד קיבעון גם ^11. לבסוף, והעמסת בכלוב יכול להיות מופעל עם רזולוציה של 3-D גבוהות מאוד, במיוחד אם מיקרוסקופיה שני הפוטונים מועסק ^12,13. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיוג השושלת על ידי והעמסת בכלוב משחררות רפרוף לייזר. Subsequenctly, שברחה מכלוב והעמסת מזוהה בו זמנית על ידי סימון עם נוגדנים עם epitopes אחרים, כגון ה-GFP.

Protocol

1. סינתזה של Caged והעמסת dextran

1. מדוד את 3.5-4 מ"ג aminodextran ולהוסיף לתוך צינור Invitrogen-סיפקה כהים המכיל 1 מ"ג של CMNB-בכלוב והעמסת SE. בידיים שלנו יחס זה נותן טעינה ממוצע של 2.5 ~ מולקולות צבע לכל dextran.
2. הוספת 500 μL של 0.1 M Na ₂ B חיץ O ₇ (borate נתרן) ₄ אל הצינור.
3. שווי ו מערבולת למשך 30 שניות לפרק את aminodextran והעמסת בכלוב.
4. בואו להגיב על לילה מערבל vortexing.
5. טוויסט את הסגר התחתון על עמודה ספין זבה ו לשחרר את הפקק. סמן נקודה על הטור עם עט. המקום עמודה צינור 15 מ"ל קונית.
6. צנטריפוגה XG ב 1000 2 דקות עם נקודה מול מרכז של הרוטור. השתמש בעמודה מיד לאחר הדחיסה.
7. המקום עמודה דחוסה בתוך שפופרת 15 מ"ל חדש חרוטי.
8. תגובה בריכת תערובת ולהעביר למרכז המיטה עמודה דחוסה שרף. החלף כובע.
9. צנטריפוגה XG ב 1000 2 דקות עם נקודה מול מרכז של הרוטור. אחרי ספין, eluent וחלקו העליון של הטור יהיה בערך באותו גוון של צבע צהוב.
10. מעבירים את eluent צהוב (~ 350 μL) אל צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge.
11. Lyophilize כדי יובש speedvac. מכסים את speedvac בנייר.
12. Re-להשעות את התוצאה ~ 2-3 מ"ג של קצף צהוב בהיר במים לריכוז סופי של 1% w / v.
13. אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בנייר מכוסה צינורות. זה רעיון טוב aliquot הפתרון dextran למנוע להקפיא הפשרת חוזרות.

2. הזרקה של Caged והעמסת dextran לעוברי דג הזברה

1. מדולל 1% w / v מלאי בכלוב והעמסת dextran 1:05 או 1:10 ב 0.2M KCl.
2. הזרק 0.5 - 1.0nL של פתרון והעמסת בכלוב בחלמון של שלב אחד עוברים באמצעות תא לחץ ההזרקה. הזריק פעם, מצמדים של עוברים חייב להישמר בחושך על 28.5 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הלא ספציפית משחררות רפרוף.
3. הסרה ידנית chorions מעוברים.
4. הרדימי עוברים tricaine 4%.
5. עוברים יהיה רכוב agarose 0.8% בצלחת פטרי 35mmx10mm, מכוסה ואחר כך עם מים ביצה.
6. לאזן agarose נמס גוש חום 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות.
7. בעזרת פיפטה זכוכית, לצייר את אחד העובר על כמות מינימלית של מים ולשחרר אותו לתוך הערה agarose:. חשוב לקרר את הצינור של agarose ביד למשך כ 30 שניות לפני לשים את העובר לתוך הצינור כדי למנוע להרוג את העובר.
8. פיפטה העובר מהצינור, יחד עם כ 50μL של agarose ו להוציא את התוכן על גבי במרכז צלחת פטרי.
9. במהירות לכוון את העובר באמצעות חוט ניילון עם התאים להיות שברחה מכלוב פונה כלפי מעלה. הערה: agarose עם מגניב כל כך מהר להיות פזיז עם המכוונת את העובר. עוברים עלולים להינזק אם מניפולציות לאחר agarose הופך נוקשה.
10. אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין (זה לוקח כמה דקות) ולמלא את שני שליש צלחת מלאה במים ביצה המכיל tricaine 4% ו PTU 0.003%.

3. לייזר משחררות רפרוף של והעמסת dextran

1. המיקרוסקופ משמש משחררות רפרוף חייב להיות אובייקטיבי 40X טבילה במים.
2. אנו משתמשים מכשירים Photonics לייזר עם תא לצבוע 365 ננומטר לבין 70% / 30% במראה לפצל dichroic.
3. לפני משחררות רפרוף, הלייזר חייב להיעשות parfocal במטרה ואת נחלש לשלטון המתאים.
4. כדי למקד את הלייזר, במקום שקופיות הזכוכית תחת שיקוף המטרה ולמקד את המטרה עד שריטות בשקופית גלויים.
5. התאם לייזר מחליש עד הלייזר יכול לייצר מאפס לעין במראה עם דופק אחד.
6. התאם את המיקוד אובייקטיבית מעלה ומטה. אם הלייזר יכול לייצר מאפס, כאשר המטרה היא מתוך המיקוד, ולהתאים את המיקוד לייזר ¼ פונים כלפי מעלה או מטה. חזור על הפעולה עד הלייזר יכול לגרד את המראה רק כאשר המטרה היא ממוקדת.
7. המקום רכוב העובר תחת המטרה ולהתמקד בתחום להיות שברחה מכלוב.
8. כדי uncage, להתמקד תא עניין הדופק הוא 10-20 פעמים בשעה 2-3 הרץ.
9. לאחר משחררות רפרוף, העובר חינם על ידי קילוף agarose משם עם מלקחיים ומכניסים אותם במים ביצה המכיל PTU 0.003%. בואו עוברים לפתח בתיבה אור חזק עד שהם קבועים.

4. נוגדן סימון וזיהוי של שברחה מכלוב והעמסת dextran

1. תקן עוברים Ab מקבע (paraformaldehyde 4%, 0.3mm CaCl _2, סוכרוז 8%, פוספט 1X שנאגרו pH מלוחים, 7.3) במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר (RT) או לילה (O / N) בשעה 4 ° C. שמור עוברים בקופסת אור חזק או עטוף בנייר אלומיניום צינור עבור כל הצעדים תיוג.
2. הסר מקבע ולהחליף MeOH 100%, להשאיר למשך 10 דקות ב RT, להסיר MeOH ו replace עם MeOH 100% טרי.
3. אחסן MeOH ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. הערה: ניתן לאחסן MeOH עד שבועיים לפני epitopes להתחיל להשפיל.
4. רעננותם עוברים עם 5 דקות על RT שוטף של פוספט MeOH/1X 75% שנאגרו מלוחים עם 0.1% Tween 20 (1X PBSTw), ואז 50% 1XPBTw MeOH/50%, אז 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך 1XPBSTw.
6. אם הם עוברים> 24 שעות הישן, permiabilize עוברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K ב 1XPBSTw. זמן Permiabilization תלויה על הבמה. חמש דקות בתוך proteinase K מספיק אם הם עוברים בין 24 ו 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). יותר זמן שיידרש, אם עבור הזחלים יותר. Re-לקבע Ab מקבע במשך 20 דקות ב RT
7. לשטוף חמש פעמים במשך 5 דקות בתוך 1XPBSTw ב RT.
8. דגירה פתרון לחסום (1XPBS, x100 טריטון 0.1%, כבשים בסרום 10%, 10% חלבון בסרום שור, sulfoxide דימתיל 1%) עבור 1-2 שעות RT.
9. מדולל נוגדנים הראשי (אנטי והעמסת בתוספת נוגדנים כנגד תאים מסוג סמנים ספציפיים) בחסימת פתרון.
10. עוברים דגירה O / N ב 4 ° C בתמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים.
11. לשטוף ארבע פעמים במשך 20 דקות ב 1XPhosphate בופר עם x100 טריטון 0.1% (PBSTx) בשעה RT.
12. מדולל fluorescently שכותרתו נוגדנים משני (בדרך כלל 1:300) בחסימת פתרון.
13. דגירה O / N ב 4 ° C בתמיסה המכילה נוגדנים משני.
14. לשטוף ארבע פעמים במשך 20 דקות ב 1XPBSTx ב RT.
15. עוברים נקה 1XPBS 50% glycerol/50% לפחות שעתיים RT, ולאחר מכן להסיר גליצרול / תערובת PBS ולהוסיף גליצרול 100% ולתת לעמוד O / N ב 4 ° C.

5. נציג תוצאות:

לאחר immunolabeling, צריך להיות אזור להעשיר של מכתים בתאים שהיו שברחה מכלוב (Figure.1). אין זה יוצא דופן לראות אות גבוה יחסית יחס רעש דג הזברה 48> שעה הישן, בשל משחררות רפרוף ספונטנית של והעמסת את.

באיור 1. תיוג שושלת של מורכבות האצטרובל דג הזברה. בגיל 24 hpf, חלק anlage האצטרובל הקדמי, שמסומן על ידי foxd3:. ביטוי של GFP, היה שברחה מכלוב באמצעות פעימות לייזר UV) על ידי 48hpf, מקבץ של צד שמאל של תאים הקרוי parapineal (עיגול אדום) התפתחה מן שברחה מכלוב תחום (עיגול לבן). B) שברחה מכלוב אות והעמסת מועשר במעגל (parapineal אדום) ואת איבר האצטרובל (עיגול לבן).

Discussion

כפי שתואר, פרוטוקול זה מספק תיוג מהיר יחסית השושלת דג הזברה השיטה בנויה על טכניקות נפוץ של microinjection, מיקרוסקופיה, ו immunofluorescence. מצאנו כי הלייזר משחררות רפרוף להיות הדרך היעילה יעיל ביותר עלות uncage והעמסת באופן מקומי. שיטה זו יכולה לשמש תווית השושלת עם נקודות הקצה ניסיוני מאוחר ככל DPF 4. עם זאת, כפי התאים מתחלקים, ריכוז בכלוב-והעמסת לכל תא בסופו של דבר מקטין מעבר רמות לגילוי. בנוסף, היו דיווחים של משחררות רפרוף ספונטנית הלא ספציפית, והעמסת של זחלים ב ¹¹ דג הזברה. כמו גילוי כזה, של והעמסת שברחה מכלוב הוא היעיל ביותר בשלב הזחל מוקדם (48-72 hpf) או קודם לכן.

השיטה המועדפת משחררות רפרוף שלנו היא על ידי שימוש בלייזר חנקן פעמו. אלה משמשים בדרך כלל עבור ניסויים כריתה התא מדויקים מספיק כדי לחרוך uncage תאים או קבוצות קטנות של תאים ^11-12. עם זאת, משחררות רפרוף יכול גם להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal: שני הפוטונים מיקרוסקופים confocal שימשו כדי להשיג משחררות רפרוף מאוד מדויק ^12. בצד השני של הספקטרום, אם הדיוק אינו נדרש אז לייזר הוא מיותר. מיקרוסקופ epifluorescent מצויד להגדיר DAPI מסנן ניתן להשתמש uncage דרך חריר קטן ^11.

מצאנו כי גילוי והעמסת שברחה מכלוב באמצעות נוגדן ראשוני נוגדנים משני ניאון פולט באורך גל אדום רחוק או אדום (למשל אלקסה 633) המתאים ביותר לצרכים שלנו. זה מאפשר לנו להבחין והעמסת שברחה מכלוב של ה-GFP מתבטא transgene (איור 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3