레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

Summary

이 프로토콜은 uncaged 플루오레신에서 신호를 증폭하기 위해 immunolabeling 전체 산 뒤에 갇힌 플루오레신의 UV - uncaging를 사용하여 셀 zebrafish의 배아의 작은 그룹의 운명을 라벨 및 추적하는 방법을 delineates.

Abstract

발달 생물학의 중심 문제는 그들이 undifferentiated 엽 성의 전구 물질로부터 발생하는 등 척추 동물에있는 무수한 세포 유형의 출처를 알아낼 것입니다. 연구원은 DiI 상표 ¹ 및 모델 시스템의 개발의 나중 단계에서 확인할 세포 운명을 추적 효소의 압력 ^주입이 같은 혈통 라벨의 다양한 방법을 고용했습니다. zebrafish (Danio rerio)의 첫 번째 운명의지도는 배아의 이산 지역에서 하나의 세포로 같은 rhodamine dextran과 같은 형광 염료의 주입에 의해 iontophoretic 조립 시간 동안 ^3-5 라벨 세포의 운명을 추적했다. 효과적인 반면,이 방법은 기술적으로 요구하고 일반적으로 zebrafish 실험실에서 찾을 수 없습니다 전문 장비가 필요합니다. 최근, 이러한 자외선에 노출되면 irreversibly 빨간색 형광 초록색에서 전환 에오스와 가에데로 photoconvertable 형광 단백질은, zebrafish ^6-8 증가 사용을 볼 수 있습니다. zebrafish 배아와 transgenesis의 상대적 용이성의 광학 선명도는 혈통의 라벨에 대해 이러한 특히 매력적인 도구를 만들었습니다 그리고 생체내 ⁷ 세포의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 그들의 유틸리티에도 불구하고,이 단백질은 염료 중재 혈통의 라벨 방법 몇 가지 단점을 비교합니다. 가장 중요한 우리는 이러한 단백질 photoconversion 동안 높은 3 - D 해상도를 얻기에서 발견 어려움이다. 이 빛 가운데, 아마도 zebrafish의 혈통 라벨에 대해 해상도와 사용 용이성에있어 최고의 조합 갇힌 플루오레신 dextran의 사용, 칭 그룹에 바인딩된 형광 염료를 만드는 마스크는 형광 ^9. 염료 다음은 형광 또는 면역의 시각화를 허용, 레이저 또는 수은 램프에서 자외선을 사용하여 특정 셀 내의 (담금질 그룹에서 발표) "uncaged"가 될 수 있습니다. iontophoretic 방법과는 달리, 우리에 갇힌 플루오레신은 표준 사출 apparatuses로 주입 수 있으며 핀홀 ¹⁰ 갖춘 epifluorescence 현미경으로 uncaged. 또한, 플루오레신에 대한 항체는 uncaged 양식을 감지하고, 에피토프는 고정 잘 남아 ^11. 마지막으로, 우리에 갇힌 플루오레신는 두 개의 광자 현미경은 ^{12,13 고용} 특히 경우, 매우 높은 3 - D 해상도 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 갇힌 플루오레신 및 레이저 uncaging에 의해 혈통 라벨의 방법을 설명합니다. Subsequenctly, uncaged 플루오레신는 항체로 분류하여 같은 GFP와 같은 다른 epitopes와 동시에 검색됩니다.

Protocol

1. 갇힌 플루오레신 Dextran의 합성

1. 3.5 밖으로 측정 - aminodextran 4 MG과 CMNB - 갇힌 플루오레신 SE 1 MG를 포함 Invitrogen - 공급 적용된 튜브에 추가합니다. 우리 손에이 비율은 dextran 당 ~ 2.5 염료 분자의 평균 로딩을 제공합니다.
2. 튜브에 0.1 M 나 ₂ B ₄ O ₇ (나트륨 borate) 버퍼 500 μL를 추가합니다.
3. aminodextran와 갇힌 플루오레신를 해산하기 위해 30 초 동안 모자 와동.
4. vortexing 믹서에서 하룻밤 반응하자.
5. Zeba의 스핀 칼럼의 맨 아래에 폐쇄를 트위스트 후 뚜껑을 느슨하게. 느낌 - 팁 펜으로 열에서 점이 표시합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 넣어 칼럼.
6. 회전자의 중심을 향하게 점 2 분 1,000 XG에 원심 분리기. 바로 압축 후 열을 사용합니다.
7. 새로운 15 ML 원뿔 튜브 압축 열의를 배치합니다.
8. 풀 반응 혼합물과 압축 열 수지 침대 센터로 전송할 수 있습니다. 뚜껑을 교체합니다.
9. 회전자의 중심을 향하게 점 2 분 1,000 XG에 원심 분리기. 스핀 후 eluent과 칼럼의 맨 위에는 약 색상 노란색 같은 그늘 것입니다.
10. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 노란색 eluent (~ 350 μL)를 전송합니다.
11. speedvac에서 건조하는 Lyophilize. 호일로 speedvac 표지.
12. 1% W / V.의 최종 농도로 물에 옅은 노란색 거품의 다시 중단 결과 ~ 2-3 MG
13. 호일 덮인 튜브에서 -20 ° C에서이 솔루션을 저장합니다. 그것은 나누어지는을 반복 냉동 해동을 방지하기 위해 dextran 솔루션 것이 좋습니다.

2. Zebrafish의 태아으로 갇힌 플루오레신 Dextran의 분사

1. 0.2M KCl에 갇힌 플루오레신 dextran 1시 5분 또는 1시 10분의 1 % W / V 주식을 희석.
2. 0.5을 주사 - 압력 주입기를 사용하여 세포 하나의 단계 배아의 노른자에 갇힌 플루오레신 솔루션 1.0nL. 일단 주입, 배아의 클러치는 ° C가 아닌 특정 uncaging을 줄이기 위해 28.5의 어둠 속에 보관해야합니다.
3. 수동으로 배아에서 chorions를 제거합니다.
4. 4퍼센트 tricaine에서 배아를 마취.
5. 배아는 다음 달걀 물로 덮여, 35mmx10mm 배양 접시에있는 0.8 % 아가로 오스에 마운트됩니다.
6. 적어도 15 분 동안 50 ° C 열 블록에 녹아 아가로 오스를 평형.
7. 유리 피펫을 사용하여 물을 최소한 한 배아를 그리기와 아가로 오스 참고로 그것을 릴리스 :. 그것은 피하기 위해 튜브로 배아를 퍼팅하기 전에 약 30 초 동안 손에 아가로 오스의 튜브를 냉각하는 것이 중요합니다 배아를 죽이는.
8. 약 50μL 아가로 오스의와 함께, 튜브의 배아를 피펫하고 페트리 접시의 중앙에 내용을 꺼냅니다.
9. 신속 동양 최대 직면 uncaged하는 세포와 플라스틱 스레드를 사용하여 배아를 참고. 시원한 신속 때문에 배아를 orienting와 서두르지와 아가로 오스. 아가로 오스는 단단한 된 후 조작하면 태아도 손상될 수 있습니다.
10. 아가로 오스가 완전히 고체화 (이 몇 분 소요) 및 4% tricaine와 0.003 %의 PTU를 포함하는 계란 물을 전체 요리 삼분의이을 채울 수 있습니다.

3. 플루오레신 Dextran의 레이저 Uncaging

1. uncaging에 사용되는 현미경 40X 물 침지 목적을 가지고 있어야합니다.
2. 우리는 365 나노미터 색소 세포와 70 % / 30 % 분할 이색성 거울 Photonics 인스 트루먼 트의 레이저를 사용합니다.
3. 이전 uncaging로, 레이저는 객관적이고 적절한 능력을 감쇠와 parfocal하셔야합니다.
4. 레이저 초점을하려면 목표 아래 미러 유리 슬라이드를 삽입하고 슬라이드에 흠집을 볼 때까지 목표를 중점을두고 있습니다.
5. 레이저가 단일 펄스와 함께 거울을 명확하게 눈에 띄는 흠집을 생산 수있을 때까지 레이저 감쇠기를 조정합니다.
6. 목표의 초점을 조정합니다 아래. 목적 초점 밖으로 때 레이저 흠집을 생산할 수있다면, 레이저 초점을 조정 ¼ 아래 켜거나. 레이저는 목적이 초점을 맞춘 경우에만 거울을 흠집 수있을 때까지 반복합니다.
7. 장소 uncaged하는 지역의 목적과 집중에 따라 배아를 탑재.
8. 새장에서 내놓다하려면, 관심의 세포에 초점을 후 2-3 Hz에서에서 그것을 10-20 번 펄스.
9. 포셉와 멀리 아가로 오스를 필링 계란 물에 퍼팅 0.003 %의 PTU를 포함하여 uncaging 후, 무료로 배아. 그들은 고정 때까지 배아가 빛을 꽉 상자에서 개발하자.

4. 항체 라벨링 및 Uncaged 플루오레신 Dextran의 감지

1. AB 정착액의 배아 수정 4 실온 (RT) 또는 야간 (O / N)에서 2-4시간 ° C.에 대한 (4 % paraformaldehyde, 0.3mM CaCl _2, 8 % 자당을 1X 인산은 살린, 산도 7.3를 버퍼) 모든 라벨 단계에 대한 가벼운 꽉 상자나 포일 싼 튜브의 배아 보관하십시오.
2. 정착액을 제거하고 100 % MeOH로 교체, RT에서 10 분 정도두고, MeOH와 repla를 제거신선한 100 % MeOH로 CE.
3. 적어도 30 분 -20 ° C에서 MeOH에 보관주의 :. epitopes가 저하하기 시작하기 전에 당신이 최대 두 주 동안 MeOH에 저장할 수 있습니다.
4. 75% MeOH/1X 인산의 RT에서 오분 세척과 배아를 Rehydrate은 0.1 % 트윈 20 (1X PBSTw)와 생리 버퍼 후 50% MeOH/50 %의 1XPBTw 다음 25% MeOH/75 % 1X PBSTw.
5. 1XPBSTw 5 분 세 번 씻으십시오.
6. 배아는> 24 시간 전거있다면, 10 μg / 1XPBSTw에 ML proteinase K와 배아를 permiabilize. Permiabilization 시간은 무대에 따라 달라집니다. 배아는 24 48시간 후 수정 (HPF) 사이하는 경우 proteinase K에 5 분 정도면 충분합니다. 더 많은 시간이 오래된 애벌레에 대한 경우 필요할 수 있습니다. RT 20 분 AB 정착액에 다시 수정
7. RT에서 1XPBSTw 5 분 다섯 번 씻으십시오.
8. RT에서 1-2시간에 대한 (1XPBS, 0.1 %의 트리톤 x100 10 % 양 혈청 10 % 소 혈청 횐자위, 1 % 디메틸 sulfoxide) 블록 솔루션에 품어.
9. 솔루션을 차단의 기본 항체 (안티 플루오레신 플러스 셀 타입의 특정 마커에 대한 항체)를 희석.
10. 4 품어 배아 O / N ° 일차 항체를 포함하는 솔루션에 C.
11. 1XPhosphate에 20 분 네 번 씻으면 RT에서 0.1 %의 트리톤 x100 (PBSTx)와 살린 버퍼.
12. 솔루션을 차단에 찬란 - 레이블 차 항체 (대개 1:300) 희석.
13. 4 품어 O / N ° 보조 항체를 포함하는 솔루션에 C.
14. RT에서 1XPBSTx에 20 분 네 번 씻으십시오.
15. RT에 적어도 두 시간 50 % glycerol/50 %의 1XPBS에 맑은 배아는 다음 글리세롤 / PBS 혼합물을 제거하고 100 % 글리세롤을 추가하고 4 O / N 서하자 ° C.를

5. 대표 결과 :

immunolabeling 후 (Figure.1) uncaged 있던 세포에 얼룩의 풍부한 공간이 있어야합니다. 그것은 플루오레신의 자연 uncaging로 인해> 48시간 이전 zebrafish에서 잡음 비율로 비교적 높은 신호를 볼 수 드문되지 않습니다.

그림 1. zebrafish 뇌의 복합 리니지 라벨. 24 HPF, foxd3로 표시 앞쪽에 뇌의 anlage의 일부, :. GFP 표현이, UV 레이저 펄스를 사용하여 uncaged했습니다)이 48hpf함으로써, 세포의 왼쪽 단면 클러스터 parapineal라고 불리는 (빨간색 동그라미) uncaged에서 등장했습니다 도메인 (화이트 서클). B)는 Uncaged 플루오레신 신호 parapineal (빨간색 동그라미의 강화)과 뇌의 기관 (흰색 동그라미).입니다

Discussion

설명한 바와 같이,이 프로토콜은 microinjection, 현미경, 그리고 immunofluorescence의 일반적으로 사용되는 기법을 기반 zebrafish에서 상대적으로 빠른 가계 라벨 방법을 제공합니다. 우리는 레이저화된 방식으로 플루오레신을 개방하다 가장 효율적이고 비용 효과적인 방법으로 uncaging 것으로 나타났습니다. 이 방법은 4 DPF 늦게 같은 실험 끝점과 혈통의 라벨을 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포가 분열로 세포 당 갇힌 - 플루오레신 농도 결국 감지 수준 이상 줄어 듭니다. 또한, zebrafish의 애벌레 ¹¹ 플루오레신의 자발적인 아닌 특정 uncaging보고 있었다. uncaged 플루오레신 이러한, 검출은 대부분 초기 애벌레 단계에 효과 (48-72 HPF) 또는 이전 버전이기 때문입니다.

우리 선호 uncaging 방법은 펄스 질소 레이저를 사용하는 것입니다. 이들은 일반적으로 세포 ablations 실험에 사용되며 그을음의 셀 또는 셀 ^11-12 작은 그룹을 개방하다 충분히 정확한입니다. 그러나, uncaging 또한 공촛점 현미경을 사용하여 수행할 수 있습니다, 두 광자 공촛점 현미경은 매우 정확한 uncaging ¹² 달성하는 데 사용되었습니다. 정밀도가 필요하지 않은 경우 스펙트럼의 다른 끝에, 다음 레이저 소모품입니다. DAPI 필터 세트를 갖춘 epifluorescent 현미경은 작은 핀홀을 통해 ¹¹ 새장에서 내놓다하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 빨간색이나 먼 빨간색 파장 (예 : 알렉사 633) 가장 잘 맞는 우리의 요구를에서 방출 차 항체 및 형광 항체를 사용하여 보조 uncaged 플루오레신의 탐지를 발견했습니다. 이것은 우리가 transgene (그림 1)에 의해 표현 GFP에서 uncaged 플루오레신을 구별하실 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3