Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

Summary

Этот протокол описывает способ маркировать и отслеживать судьбу малых групп эмбрионов данио клетки с помощью УФ-uncaging в клетке флуоресцеина, после чего весь горе immunolabeling для усиления сигнала от Uncaged флуоресцеина.

Abstract

Центральной проблемой в биологии развития, является вывести происхождение множества типов клеток, присутствующих в позвоночных, как они возникают из недифференцированных предшественников. Исследователи использовали различные методы маркировки линии, такие как DII маркировки ¹ и давление впрыска прослеживаемых ферменты ² выяснить судьбу ячейки на более поздних стадиях развития в модельных системах. Первые карты судьбы в данио (Danio rerio) были собраны iontophoretic инъекции флуоресцентных красителей, таких, как родамин декстран, в одиночных камерах в дискретных регионов эмбриона и отслеживания судьбы помечены ячейки со временем ^3-5. Хотя эффективные, эти методы технически сложные и требуют специализированного оборудования, не часто встречается в данио лабораториях. В последнее время photoconvertable флуоресцентные белки, такие как Eos и Kaede, который необратимо переключаться с зеленого на красный флуоресценции при воздействии ультрафиолетового света, видим широкое использование в данио ^6-8. Оптическая ясность данио эмбриона и относительной легкостью трансгенеза сделали эти инструменты особенно привлекательными для линии маркировки и наблюдать миграцию клеток в естественных условиях ^7. Несмотря на свою полезность, эти белки имеют некоторые недостатки по сравнению с красителем-опосредованных методов линии маркировки. Наиболее важным является трудность, мы нашли в получении высоких 3-D резолюции в ходе фотопреобразования этих белков. В свете этого, может быть, лучшее сочетание разрешение и простоту использования для маркировки линии в данио использует клетке флуоресцеина декстран, флуоресцентный краситель, который связан с тушением группа, которая маскирует его флуоресценции ^9. Красителя может быть "Uncaged" (освобожден от закалки группы) в пределах определенной ячейке с помощью УФ света от лампы лазер или ртути, что позволяет визуализировать его флуоресценции или иммунодетекции. В отличие от iontophoretic методы, флуоресцеин клетке может быть введен со стандартными аппаратами впрыска и Uncaged с epifluorescence микроскопа, снабженного отверстием ^10. Кроме того, антитела против флуоресцеина обнаружить только Uncaged форме, и эпитоп выживает фиксации и ^11. Наконец, флуоресцеин клетке может быть активирована с очень высоким 3-D разрешение, особенно если двухфотонной микроскопии используется ^12,13. Этот протокол описывает метод маркировки линии по клетке флуоресцеина и лазерной uncaging. Subsequenctly, Uncaged флуоресцеина обнаруживается одновременно с другими эпитопов, таких как GFP путем маркировки с антителами.

Protocol

1. Синтез клетке Fluorescein Декстран

1. Отмерьте 3,5 - 4 мг aminodextran и добавить в Invitrogen поставляемых тонированные пробирку, содержащую 1 мг CMNB-клетке флуоресцеина SE. В наших руках это соотношение дает среднюю загрузку ~ 2,5 молекул красителя в декстран.
2. Добавить 500 мкл 0,1 М Na ₂ B ₄ O ₇ буфера (натрия борат) к трубе.
3. Кап и вихревые в течение 30 секунд, чтобы растворить и aminodextran клетке флуоресцеина.
4. Давайте реагировать на ночь на вортексе смесителя.
5. Twist со дна закрытия на колонке спина Zeba и ослабьте крышку. Марк точка на колонку с фломастером. Место колонку в 15-мл коническую трубку.
6. Центрифуга при 1000 мкг в течение 2 мин с точкой перед центром ротора. Используйте колонку сразу после уплотнения.
7. Место уплотненного столбца в новый 15-мл коническую трубку.
8. Бассейн реакционной смеси и трансфер в центре уплотненной кровать смолы колонку. Замените крышку.
9. Центрифуга при 1000 мкг в течение 2 мин с точкой перед центром ротора. После спина, элюента и верхней части колонны будет примерно такой же оттенок желтого цвета.
10. Передача желтых элюента (~ 350 мкл) в 1,5-мл микроцентрифужных трубки.
11. Lyophilize досуха в speedvac. Обложка speedvac с фольгой.
12. Повторное приостановить результате ~ 2-3 мг бледно-желтой пены в воде до конечной концентрации 1% мас. /
13. Хранить раствор при -20 ° C в фольге покрытых труб. Это хорошая идея, чтобы аликвоту решение декстран для предотвращения повторного замораживания-оттаивания.

2. Инъекция клетке Fluorescein Декстран в эмбрионы данио рерио

1. Развести 1% вес / запас клетке флуоресцеина декстран 1:5 или 1:10 в 0,2 М KCl.
2. Inject 0,5 - 1.0nL в клетке флуоресцеина раствора в желток одного клеточной стадии эмбрионов использованием давления инжектор. Как только вводится, муфты эмбрионов должна храниться в темном месте при 28,5 ° С до снижения неспецифической uncaging.
3. Вручную удалите chorions из эмбрионов.
4. Обезболить эмбрионов в 4% tricaine.
5. Эмбрионы будет установлен в 0,8% агарозном в блюдо 35mmx10mm Петри, затем покрывается яйцо водой.
6. Равновесия расплавленного агарозы в 50 ° тепла блока С в течение не менее 15 минут.
7. Использование стеклянной пипетки, составить одного эмбриона в минимальном количестве воды и передаю его в агарозном. Примечание: Важно, чтобы охладить трубки агарозы в вашей руке в течение приблизительно 30 секунд до ввода эмбриона в трубку, чтобы избежать убийство эмбриона.
8. Внесите эмбрион из пробирки, наряду с примерно 50 мкл агарозы и извлечь содержимое на центр чашке Петри.
9. Быстро сориентироваться эмбриона с помощью пластикового тема с ячейки, которые будут Uncaged вверх. Примечание: агарозы с прохладной быстро, так спешите с ориентирующими эмбриона. Эмбрионы могут быть повреждены, если манипулировать после агарозном становится жесткой.
10. Разрешить агарозы, чтобы полностью укрепить (это занимает несколько минут) и залейте блюдо 2 / 3 полный с яйцом воды, содержащей 4% tricaine и 0,003% ПТУ.

3. Лазерная Uncaging флуоресцеина Декстран

1. Микроскоп используется для uncaging должны иметь 40X цель погружением в воду.
2. Мы используем инструменты Фотоника-лазера с 365 нм ячейки красителя и 70% / 30% раскол дихроичных зеркал.
3. До uncaging, лазер должен быть сделан парфокальное с целью и ослабленный к соответствующей мощности.
4. Для фокусировки лазерного, место слайд зеркальные стекла под цели и сосредоточиться цель до царапин на слайде видны.
5. Настройте лазер аттенюатора до лазера может производить хорошо видны царапины в зеркало с одного импульса.
6. Отрегулируйте цель фокус вверх и вниз. Если лазер может производить нуля, когда цель находится не в фокусе, настройте лазерного фокуса ¼ оборота вверх или вниз. Повторяйте, пока лазер может поцарапать зеркало только тогда, когда цель находится в фокусе.
7. Место установлен эмбриона под цели и сосредоточиться на области, которая будет Uncaged.
8. Чтобы выпускать из клетки, сосредоточиться на ячейку интерес и пульса 10-20 раз в 2-3 Гц.
9. После uncaging, бесплатное эмбриона путем снятия агарозном покончить с пинцетом и положить их в яичном воды, содержащей 0,003% ПТУ. Давайте эмбрионы развиваются в светонепроницаемый ящик, пока они не являются фиксированными.

4. Маркировка антител и обнаружение Uncaged Fluorescein Декстран

1. Fix эмбрионов в Ab фиксатор (4% параформальдегида, 0,3 CaCl _2, 8% сахарозы, 1X фосфатно-солевым буфером, рН 7,3) в течение двух-четырех часов при комнатной температуре (RT) или на ночь (O / N) при 4 ° C. Держите эмбрионов в светонепроницаемый ящик или фольгой обернут трубки для маркировки всех шагов.
2. Удалить фиксатор и заменить 100% метанола, оставьте на 10 минут при комнатной температуре, удалить метанола и replaсе со свежими 100% метанола.
3. Хранить в метаноле при -20 ° С в течение не менее 30 минут. Примечание: Вы можете хранить в метаноле в течение двух недель до эпитопов начинают деградировать.
4. Увлажняет эмбрионов с 5 минут при комнатной температуре моет 75% фосфатов MeOH/1X буферным раствором с 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), то 50% MeOH/50% 1XPBTw, то 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Вымойте три раза в течение 5 минут в 1XPBSTw.
6. Если эмбрионы> 24 часа, permiabilize эмбрионов с 10 мкг / мл протеиназы К в 1XPBSTw. Permiabilization время зависит от стадии. Через пять минут в протеиназы К достаточно, если эмбрионы от 24 до 48 часов после оплодотворения (HPF). Больше времени может потребоваться, если для старших личинок. Повторное исправление в Ab фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре
7. Вымойте пять раз в течение 5 минут в 1XPBSTw при комнатной температуре.
8. Инкубируйте в блоке решения (1XPBS, 0,1% Тритон x100, 10% овец сыворотки, 10% Бычий сывороточный альбумин, 1% диметилсульфоксид) в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
9. Развести первичных антител (анти-флуоресцеин плюс антител против камерного типа специфических маркеров) в блокировании решения.
10. Инкубируйте эмбрионов O / N при температуре 4 ° С в растворе, содержащем первичные антитела.
11. Вымойте четыре раза в течение 20 минут в 1XPhosphate буферным раствором с 0,1% Тритон x100 (PBSTx) при комнатной температуре.
12. Развести флуоресцентно меченых вторичных антител (как правило, 1:300) в блокировании решения.
13. Инкубируйте O / N при температуре 4 ° С в раствор, содержащий вторичные антитела.
14. Вымойте четыре раза в течение 20 минут в 1XPBSTx при комнатной температуре.
15. Очистить эмбрионов в 50% glycerol/50% 1XPBS по крайней мере двух часов при комнатной температуре, а затем удалить глицерин / PBS смесь и добавить 100% глицерина и дать постоять O / N при 4 ° C.

5. Представитель Результаты:

После immunolabeling, не должно быть обогащенной области окрашивания в клетках, которые были Uncaged (рис.1). Это не является необычным, чтобы увидеть сравнительно высоким отношением сигнал-шум в> 48 час старые данио, из-за спонтанного uncaging из флуоресцеина.

Рисунок 1. Lineage маркировки комплекс данио шишковидной. На 24 HPF, часть передней шишковидной закладки, обозначенное foxd3. GFP выражение, был Uncaged с помощью УФ лазерных импульсов) По 48hpf, левосторонний скопления клеток, которые называются parapineal (красный круг) сложилась в Uncaged домена (белый круг). Б) Uncaged сигнал флуоресцеина обогащается parapineal (красный круг) и шишковидная органа (белый круг).

Discussion

Как описано, этот протокол обеспечивает относительно быстрый метод линии маркировки в данио, которая построена на часто используемые методы микроинъекции, микроскопии и иммунофлюоресценции. Мы обнаружили, что лазерная uncaging быть наиболее эффективным и экономически эффективный способ выпускать из клетки флуоресцеина в локализованной моды. Этот метод может быть использован для линии этикетку с экспериментальными конечные точки, как в конце 4 денье. Однако, как клетки делятся, в клетке-флуоресцеина концентрации в конечном итоге клетка уменьшается за обнаружению уровней. Кроме того, появились сообщения о спонтанном, неспецифический uncaging флуоресцеина в данио личинок ^11. Таким образом, обнаружение Uncaged флуоресцеина наиболее эффективен в начале личиночной стадии (48-72 HPF) или ранее.

Наш предпочтительный метод uncaging является использование импульсного лазера азота. Они обычно используются для сотовых абляции экспериментов и достаточно точны, чтобы выпускать из клетки опалить клетки или небольшие группы клеток ^11-12. Тем не менее, uncaging также может быть выполнено с помощью конфокальной микроскопии; двухфотонного конфокальные микроскопы были использованы для достижения очень точные uncaging ^12. На другом конце спектра, если точность не требуется, то лазер необязательной. Epifluorescent Микроскоп оснащен набором DAPI фильтр может быть использован для выпускать из клетки через небольшое отверстие ^11.

Мы обнаружили, что обнаружение Uncaged флуоресцеина использованием первичного антитела и флуоресцентные вторичными антителами, излучающий в красном или дальней красной длине волны (например, Alexa 633) лучше всего подходит для наших потребностей. Это позволяет нам выделить Uncaged флуоресцеина из GFP выраженное трансгенов (рис. 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3