Lineage Märkning av Zebrafish Celler med laser Uncagable Fluorescein Dextran

Summary

Detta protokoll skisserar ett sätt att märka och spåra öde små grupper av celler zebrafisk embryon med hjälp av UV-uncaging i bur fluorescein, följt av hela berget immunolabeling att förstärka signalen från uncaged fluorescein.

Abstract

Ett centralt problem i utvecklingsbiologi är att härleda ursprunget till de otaliga celltyper som förekommer i ryggradsdjur, eftersom de härrör från odifferentierade förstadier. Forskare har använt olika metoder för härstamning märkning, såsom DII märkning ¹ och tryck injektion av spårbar enzymer ² att ta reda på cell öde i senare skeden av utvecklingen i modellsystem. Den första öde Kartorna i zebrafisk (Danio rerio) samlades av jontoforetiskt injektion av fluorescerande färger, såsom Rhodamine dextran, i enstaka celler i diskreta delar av embryot och spåra den märkta cellens öde över tiden ^3-5. Medan effektiva är dessa metoder kräver tekniskt och kräver specialiserad utrustning som inte är vanliga i zebrafisk laboratorier. Nyligen har photoconvertable fluorescerande proteiner, som Eos och Kaede, som oåterkalleligt växlar från grönt till rött fluorescens när de utsätts för ultraviolett ljus, ser en ökad användning i zebrafisk ^6-8. Den optiska klarhet zebrafisk embryot och relativt lätt att genmodifiering har gjort dessa särskilt intressant verktyg för härstamning märkning och att observera migration av celler in vivo ^7. Trots deras nytta, har dessa proteiner vissa nackdelar jämfört med dye-medierad metoder härstamning märkning. Det mest avgörande är hur svårt vi har funnit att få höga 3-D-upplösning under photoconversion av dessa proteiner. I ljuset av detta, kanske den bästa kombinationen av upplösning och användarvänlighet för härstamning märkning zebrafisk använder sig av bur fluorescein dextran, en fluorescerande färg som är bunden till en släcka grupp som döljer dess fluorescens ^9. Färgen kan sedan "uncaged" (frisätts från släckning gruppen) inom en viss cell med hjälp av UV-ljus från en laser eller kvicksilverlampa, vilket gör visualisering av dess fluorescens eller immunodetection. Till skillnad från jontoforetiskt metoder kan bur fluorescein injiceras med standard injektion apparater och uncaged med ett epifluorescensmikroskop försedd med ett hål ^10. Dessutom antikroppar mot fluorescein upptäcka bara uncaged form och epitop överlever fixering väl ^11. Slutligen kan bur fluorescein aktiveras med mycket hög 3-D-upplösning, särskilt om två-photon mikroskopi är anställd ^12,13. Detta protokoll beskriver en metod för härstamning märkning av bur fluorescein och laser uncaging. Subsequenctly är uncaged fluorescein upptäcks samtidigt med andra epitoper som GFP genom märkning med antikroppar.

Protocol

1. Syntes av Caged Fluorescein Dextran

1. Mät Out 3.5 - 4 mg av aminodextran och lägga in i Invitrogen-medföljande tonade rör innehållande 1 mg CMNB bur-fluorescein SE. I våra händer detta förhållande ger en genomsnittlig belastning på ~ 2,5 färgämne molekyler per dextran.
2. Tillsätt 500 mikroliter av 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ (natriumborat) buffert till röret.
3. Locket och skaka i 30 sekunder för att upplösa aminodextran och bur fluorescein.
4. Låt reagera över natten på ett vortexa mixer.
5. Vrid av botten stängningen på en Zebran spin kolumn och lossa locket. Markera en prick på kolonnen med en tuschpenna. Placera kolonnen i en 15-ml konisk tub.
6. Centrifugera vid 1000 xgi 2 min med pricken mot centrum av rotorn. Använd kolumnen omedelbart efter packning.
7. Placera komprimeras kolumn i en ny 15-ml konisk tub.
8. Pool reaktionsblandningen och transfer till centrum av den packade kolonnen hartskolonnen. Sätt tillbaka locket.
9. Centrifugera vid 1000 xgi 2 min med pricken mot centrum av rotorn. Efter spin kommer eluenten och toppen av kolumnen vara ungefär samma nyans av gul färg.
10. Överför den gula eluenten (~ 350 mikroliter) med en 1,5-mL mikrocentrifugrör.
11. Lyophilize till torrhet i en speedvac. Täck speedvac med folie.
12. Återuppslamma resulterande ~ 2-3 mg ljusgul skum i vatten till en slutlig koncentration av 1% w / v.
13. Förvara lösningen vid -20 ° C i folie täckt-rör. Det är en bra idé att delmängd av dextran lösning för att förhindra upprepade frys-tina.

2. Injektion av Caged Fluorescein Dextran Into Zebrafish embryon

1. Späd 1% w / v lager av bur fluorescein dextran 1:05 eller 1:10 i 0,2 KCl.
2. Injicera 0,5 - 1.0nL i bur fluorescein lösning i äggulan i en embryon cell stadium med hjälp av ett tryck injektor. När injiceras, måste klor embryon förvaras mörkt vid 28,5 ° C för att minska icke-specifika uncaging.
3. Manuellt ta bort chorions från embryon.
4. Bedöva embryon i 4% tricaine.
5. Embryon kommer att monteras i 0,8% agaros i 35mmx10mm petriskål, sedan täcks med ägg vatten.
6. Jämvikta smält agaros i 50 ° C värmeblock i minst 15 minuter.
7. Med hjälp av en glaspipett upprätta ett embryo i en minimal mängd vatten och släpp den i agarosen. OBS: Det är viktigt att kyla tub agaros i handen i ungefär 30 sekunder innan du sätter embryot i röret för att undvika döda embryot.
8. Pipettera embryot från röret, tillsammans med cirka 50μL av agaros och mata ut innehållet på mitten av petriskål.
9. Snabbt orientera embryot med hjälp av en plast tråd med celler som skall uncaged uppåt. OBS: agaros med kallt snabbt så förhasta med orientera embryot. Embryon kan skadas om manipuleras efter agarosen blir stel.
10. Låt agarosen att helt stelna (detta tar några minuter) och fyll skålen två tredjedelar med ägg vatten innehållande 4% tricaine och 0,003% PTU.

3. Laser Uncaging av Fluorescein Dextran

1. Mikroskopet används för uncaging måste ha en 40X objektiv nedsänkning i vatten.
2. Vi använder en Photonics instrument laser med 365 nm färgen cellen och 70% / 30% split dikroiskt spegel.
3. Innan uncaging måste lasern göras parfocal med målet och försvagade till lämplig makten.
4. Att fokusera lasern, placera ett spegelglas glider under mål och fokusera målet tills repor i bilden är synliga.
5. Justera laser dämpare fram lasern kan producera en väl synlig repa i spegeln med en enda puls.
6. Justera målet fokus upp och ner. Om lasern kan producera en repa när målet är ur fokus, justera lasern fokus ¼ varv uppåt eller nedåt. Upprepa tills lasern kan repa spegeln endast när målet är fokuserad.
7. Placera monterad embryo enligt mål och fokusera på det område som ska uncaged.
8. För att uncage, fokusera på en cell av intresse och pulsen den 10-20 gånger vid 2-3 Hz.
9. Efter uncaging, fri embryot genom att dra agaros bort med pincett och sätta dem i ägg vatten innehållande 0,003% PTU. Låt embryon utvecklas i en ljus-tight box tills de är fasta.

4. Antikropp märkning och detektion av Uncaged Fluorescein Dextran

1. Fix embryon i Ab fixativ (4% paraformaldehyd, 0.3mm CaCl _2, 8% sackaros, buffrat 1X Fosfat saltlösning, pH 7,3) under två till fyra timmar i rumstemperatur (RT) eller över natten (O / N) vid 4 ° C. Håll embryon i en ljus tät låda eller folie förpackade rör för all märkning steg.
2. Ta bort fixativ och ersätt med 100% MeOH, låt stå i 10 minuter vid RT, ta bort MeOH och Replace med färska 100% MeOH.
3. Förvaras i MeOH vid -20 ° C i minst 30 minuter. OBS: Du kan lagra i MeOH i upp till två veckor innan epitoper börjar brytas ned.
4. Rehydrera embryon med 5 minuters tvättar i RT 75% MeOH/1X Fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), därefter 50% MeOH/50% 1XPBTw, sedan 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Tvätta tre gånger i 5 minuter i 1XPBSTw.
6. Om embryon> 24 timmar gammal, permiabilize embryon med 10 mikrogram / ml proteinas K i 1XPBSTw. Permiabilization tiden är beroende på scen. Fem minuter i proteinas K är tillräckligt om de embryon är mellan 24 och 48 timmar efter befruktning (HPF). Mer tid kan behövas om för äldre larver. Re-fix i Ab fixativ i 20 minuter vid RT
7. Tvätta fem gånger i 5 minuter i 1XPBSTw vid RT.
8. Inkubera i block lösning (1XPBS, 0,1% Triton X100, 10% får serum, 10% bovint serum äggvita, 1% Dimetylsulfoxid) i 1-2 timmar vid RT.
9. Späd primära antikroppar (anti-fluorescein plus antikroppar mot celltyp specifika markörer) i blockerande lösningen.
10. Inkubera embryon O / N vid 4 ° C i lösning som innehåller primära antikroppar.
11. Tvätta fyra gånger under 20 minuter i 1XPhosphate saltlösning med 0,1% Triton X100 (PBSTx) vid RT.
12. Späd fluorescerande-märkta sekundära antikroppar (vanligen 1:300) i blockerande lösningen.
13. Inkubera O / N vid 4 ° C i lösning som innehåller sekundära antikroppar.
14. Tvätta fyra gånger under 20 minuter i 1XPBSTx vid RT.
15. Klart embryon i 50% glycerol/50% 1XPBS i minst två timmar vid RT, ta sedan bort glycerol / PBS blandningen och tillsätt 100% glycerol och låt stå O / N vid 4 ° C.

5. Representativa resultat:

Efter immunolabeling bör det finnas ett berikat område färgning i de celler som uncaged (fig 1). Det är inte ovanligt att se en relativt hög signal-brus-förhållandet i> 48 timmar gammalt zebrafisk, på grund av spontana uncaging av fluorescein.

Figur 1. Lineage märkning av zebrafisk tallkottkörteln komplex. Vid 24 HPF, en del av den främre tallkottkörteln Anlage, indikeras av foxd3:. GFP uttryck, var uncaged med UV-laser pulser) A genom 48hpf, en så kallad vänstersidig kluster av celler i parapineal (röd cirkel) har vuxit fram ur uncaged domän (vit cirkel). B) Uncaged fluorescein signal anrikas i parapineal (röd cirkel) och tallkottkörteln orgel (vit cirkel).

Discussion

Som beskrivits ger detta protokoll en relativt snabb metod härstamning märkning zebrafisk som är byggd på de vanligaste teknikerna för mikroinjektion, mikroskopi och immunofluorescens. Vi har funnit att laser uncaging att vara den mest effektiva och kostnadseffektiva sättet att uncage fluorescein i en lokal sätt. Denna metod kan användas för härstamning etikett med experimentella ändpunkter så sent som 4 DPF. Men eftersom cellerna delar, den bur-fluorescein koncentration per cell sjunker så småningom bortom detekterbara nivåer. Dessutom har det förekommit rapporter om spontana, icke-specifika uncaging av fluorescein i zebrafisk larver ^11. Som sådan upptäckt av uncaged fluorescein är mest effektiv i början av larvstadium (48-72 HPF) eller tidigare.

Vår föredras uncaging metoden är med hjälp av en pulsad kväve laser. Dessa används ofta för cell ablationer experiment och är tillräckligt noggranna för att uncage singe celler eller små grupper av celler ^11-12. Däremot kan uncaging även åstadkommas med hjälp av ett konfokalmikroskop, två-photon konfokala mikroskop har använts för att uppnå mycket exakta uncaging ^12. På andra änden av skalan, om precisionen inte krävs då en laser är onödigt. En epifluorescent mikroskop utrustat med en DAPI filter som kan användas för att uncage genom ett litet hål ^11.

Vi har funnit att upptäcka uncaged fluorescein med en primär antikropp och fluorescerande sekundär antikropp som avger vid rött eller långt-röd våglängd (t.ex. Alexa 633) passar våra behov. Detta tillåter oss att skilja uncaged fluorescein från GFP som uttrycks av en transgen (figur 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3