Lazer Uncagable Floresein Dextran'ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

Summary

Bu protokol, Uncaged floresein gelen sinyali yükseltmek için immunolabeling tüm montaj takip kafesli flöresein UV uncaging kullanarak hücrelerin zebrafish embriyoların küçük gruplar kaderi etiket ve takip etmek için bir yol çizer.

Abstract

Gelişimsel biyoloji merkezi bir sorun farklılaşmamış öncüleri olarak ortaya çıkan omurgalıların bulunan sayısız hücre tiplerinin kökenini anlamak için. Araştırmacılar DII etiketleme ¹ ve model sistemler geliştirme sonraki aşamalarında tespit hücre kaderinin izlenebilir enzimlerin basınçlı enjeksiyon ² gibi soy etiketleme çeşitli yöntemleri, istihdam var. Zebra balığı (Danio rerio) ilk kaderi haritalar rodamin dekstran gibi floresan boyalar, iyontoforez enjeksiyon yoluyla embriyo ayrık bölgelerinde tek hücrelerin içine monte edilmiş ve üzerinden etiketli hücrenin kaderini izleme süresi ^3-5. Etkili olsa da, bu yöntemlerin teknik olarak zor ve yaygın zebrafish laboratuarları bulunan olmayan özel ekipman gerektirmez. Son zamanlarda, ultraviyole ışığa maruz kaldığında yeşil kırmızı floresan geri dönüşümsüz geçiş Eos ve Kaede photoconvertable floresan proteinleri, zebrafish ^6-8 artış görüyoruz. Zebrafish embriyo ve transgenesis göreli kolaylığı optik netlik soy etiketlenmesi için bu özellikle çekici araçlar yapmış ve in vivo ⁷ hücrelerin göç gözlemlemek için. Onların yardımcı programı olmasına rağmen, bu proteinlerin, boya-aracılı soy etiketleme yöntemleri, bazı dezavantajları karşılaştırıldığında var. En önemli zorluk biz Fotoçevrim sırasında bu proteinlerin 3 boyutlu yüksek çözünürlük elde bulduk. Bu ışık, belki de çözünürlüğü ve kullanım kolaylığı zebrafish soy etiketleme için en iyi kombinasyonu kafesli floresein dekstran kullanımı, su verme grubuna bağlı bir floresan boya yapar, maskeler, ^floresan 9 . Sonra boya, floresan veya İmmuno görselleştirme sağlayan bir lazer veya cıva lambası, UV ışık kullanarak belirli bir hücre içinde (su verme grubu serbest) "Uncaged" olabilir. Iyontoforez yöntemlerinin aksine, kafesli floresein standart enjeksiyon aparatları ile enjekte edilir ve bir iğne deliği ¹⁰ ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile Uncaged. Buna ek olarak, floresein karşı antikor sadece Uncaged formu tespit ve epitop fiksasyonu iyi ¹¹ hayatta. Son olarak, kafesli floresein iki foton mikroskopi ^12,13 istihdam, özellikle çok yüksek 3-D çözünürlük ile aktive olabilir. Bu protokol, kafesli floresein ve lazer uncaging soy etiketleme bir yöntem açıklanır. Subsequenctly, Uncaged floresein antikorlar ile etiketleme gibi GFP gibi diğer epitopları ile eş zamanlı olarak algılanır.

Protocol

1. Kafesli Floresein Dextran'ın Sentezi

1. 3.5 Tedbir - aminodextran 4 mg ve 1 mg CMNB-kafesli floresein GD içeren Invitrogen sağlanan renkli bir tüp içine ekleyin. Bizim ellerde bu oran ortalama bir yükleme ~ dekstran ortalama 2.5 boya molekülleri verir.
2. Tüp 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ (sodyum borat) tampon 500 mcL ekleyin.
3. Cap ve aminodextran ve kafesli floresein çözmek için 30 saniye karıştırın.
4. Vorteks karıştırıcı gecede tepki olsun.
5. Zeba spin kolon alt kapatma Twist ve kapağı gevşetin. Bir keçeli kalem ile sütun üzerinde bir nokta işaretleyin. 15 ml konik tüp yerleştirin sütun.
6. Rotor merkezi karşılaştığı nokta ile 2 dakika süreyle 1000 xg'de santrifüjleyin. Hemen sıkıştırma sonra sütunu kullanın.
7. Yeni bir 15-ml konik tüp sıkıştırılmış sütunu yerleştirin.
8. Havuzu reaksiyon karışımı ve sıkıştırılmış sütun reçine yatak merkezine transfer. Kapağını takın.
9. Rotor merkezi karşılaştığı nokta ile 2 dakika süreyle 1000 xg'de santrifüjleyin. Spin sonra Eluent ve sütunun üst kabaca aynı renk sarı gölge olacaktır.
10. Sarı Eluent (~ 350 mcL) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
11. Bir speedvac kuruluk Lyophilize. Speedvac folyo ile örtün.
12. % 1 w / v nihai konsantrasyonu, su, soluk sarı köpük, yeniden askıya çıkan ~ 2-3 mg
13. Bu çözüm folyo kaplı tüplerde -20 ° C'de saklayın. Bu kısım tekrarlayan donma-çözülme önlemek için dekstran çözüm iyi bir fikirdir.

2. Zebra balığı Embriyolar içine Kafesli Floresein Dextran'ın Enjeksiyon

1. 0,2 M KCl kafesli floresein dekstran 1:5 veya 1:10% 1 w / v hisse senedi sulandırınız.
2. 0.5 enjekte basıncı enjektör kullanarak bir hücre dönem embriyoların yumurta sarısı içine kafesli floresein çözüm, 1.0nL. Bir kez enjekte edilen embriyolar, kavramalar ° C, non-spesifik uncaging azaltmak için 28.5 karanlıkta muhafaza edilmelidir.
3. El embriyolardan chorions çıkarın.
4. 4% tricaine embriyolar anestezisi.
5. Embriyolar 35mmx10mm petri sonra yumurta su ile kaplı,% 0.8 agaroz monte olacak.
6. En az 15 dakika süreyle 50 ° C ısı bloğu içinde erimiş agaroz dengelenmesi.
7. Cam bir pipet kullanarak, az miktarda su, tek bir embriyo çizmek ve agaroz Not içine bırakın. Önlemek için embriyo tüp içine koyarak, yaklaşık 30 saniye önce elinizde agaroz tüp soğutmak için önemlidir . embriyonun öldürülmesi.
8. Agaroz, yaklaşık 50μL ile birlikte, embriyo tüp Pipet ve petri merkezi üzerine içeriğini çıkarmak.
9. Hızla şark yukarı bakacak Uncaged hücreleri ile plastik bir iş parçacığı kullanarak embriyo Not: serin hızlı embriyo yönlendirilmesi ile acele agaroz. Agaroz katı olduktan sonra manipüle eğer Embriyolar zarar görebilir.
10. Agaroz tamamen katılaşmaya (bu birkaç dakika sürer) ve% 4 ve% 0.003 tricaine PTU içeren yumurta su ile dolu çanak üçte ikisi doldurmak için izin verin.

3. Lazer Uncaging Floresein Dextran'ın

1. Uncaging için kullanılan mikroskop, 40X suya daldırma hedefi sahip olması gerekir.
2. Biz, 365 nm boya hücre ve% 70 /% 30 split dikroik ayna ile bir Fotonik Instruments lazer kullanır.
3. Önce uncaging, lazer, objektif ve uygun güç için zayıflatılmış parfocal yapılmalıdır.
4. Lazer odaklanmak için, aynalı cam slayt hedefi altında bir yerde ve slayt çizikler görülebilir kadar objektif odak.
5. Lazer, tek bir darbe ile ayna açıkça görünür bir çizik üretebilecek hale gelene kadar lazer zayıflatıcı ayarlayın.
6. Objektif odak yukarı ve aşağı doğru ayarlayın. Objektif odak dışında olduğunda lazer bir çizik üretebilir, lazer odağı ayarlamak ¼ açmak veya aşağı yukarı. Lazer ayna sadece amaç odaklı çizebilir kadar tekrarlayın.
7. Place Uncaged alan amaç ve odak altında embriyo monte edilebilir.
8. Uncage için, bir hücre ilgi odağı ve 2-3 Hz'de 10-20 kez darbe.
9. Forseps ile agaroz soyma ve yumurta su koyarak% 0.003 PTU içeren uncaging sonra, embriyo. Sabit oluncaya kadar embriyolar bir ışık geçirmez kutu gelişir.

4. Antikor Etiketleme ve Uncaged Floresein Dextran'ın Algılama

1. Ab fiksatif embriyolar Fix 4 2-4 saat oda sıcaklığında (RT) ya da gecelik (O / N) ° C (% 4 paraformaldehid, 0.3mm _{CaCl 2,%} 8 sakaroz, 1X Fosfat Tuzlu, pH 7,3 Tamponlu ) Etiketleme tüm adımlar için, ışık geçirmez bir kutu veya folyo sarılmış tüp embriyolar tutun.
2. Fiksatif çıkarın ve% 100 MeOH ile değiştirin, oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, MeOH ve Repla kaldırmak% 100 taze MeOH ile ce.
3. -20 ° C'de en az 30 dakika süreyle MeOH Mağaza Not: epitoplar düşmeye başlamadan önce, iki hafta kadar için MeOH saklayabilirsiniz .
4. % 75 MeOH/1X Fosfat RT 5 dakika yıkar embriyo rehidrate tamponlu tuzlu su ile% 0.1 Tween 20 (1X PBSTw), daha sonra% 50% MeOH/50 1XPBTw, daha sonra% 25 MeOH/75% 1X PBSTw.
5. 1XPBSTw 5 dakika için üç kez yıkayın.
6. Eğer embriyolar> 24 saat, 10 mikrogram / mL proteinaz K 1XPBSTw embriyo permiabilize. Permiabilization zaman sahnede bağlıdır. Embriyolar, 24 ve 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) arasında olup olmadığını proteinaz K Beş dakika yeterlidir. Eğer eski larvaları için daha fazla zaman gerekebilir. RT 20 dakika Ab fiksatif Re-fix
7. RT 1XPBSTw 5 dakika süreyle beş kez yıkayın.
8. Oda sıcaklığında 1-2 saat (1XPBS,% 0.1 Triton x100,% 10 koyunu serum,% 10 Bovine serum albümin,% 1 Dimetil sülfoksit) blok çözüm inkübe edin.
9. Çözümü engelleme primer antikorları (anti-floresein artı hücre türüne özgü belirteçler karşı antikorlar) sulandırınız.
10. 4 inkübe embriyolar O / N ° C primer antikorları içeren bir çözüm.
11. 1XPhosphate 20 dakika boyunca dört kez yıkayın RT% 0,1 Triton x100 (PBSTx) Tuzlu Tamponlu.
12. Çözümü engelleme floresan etiketli sekonder antikor (genellikle 1:300) sulandırınız.
13. 4 inkübe O / N ° C sekonder antikorlar içeren bir çözüm.
14. RT 1XPBSTx 20 dakika boyunca dört kez yıkayın.
15. RT en az iki saat için 50% glycerol/50% 1XPBS net embriyolar, daha sonra kaldırmak gliserol / PBS karışımı ve% 100 gliserol ekleyin ve bekletin 4 O / N ° C

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Immunolabeling sonra, (Şekil.1) Uncaged hücrelerinde boyanma zengin bir alan olmalıdır. Floresein spontan uncaging nedeniyle, nispeten yüksek bir sinyal gürültü oranı> 48 saat eski Zebra balığı görmek için alışılmadık bir durum değildir.

Şekil 1 zebrafish epifiz kompleks Lineage etiketleme. Hpf foxd3 tarafından belirtilen ön epifiz anlage bir kısmı, 24 yaşında GFP ifade, UV lazer darbeleri kullanarak Uncaged A) 48hpf olarak, hücrelerin sol taraflı bir küme parapineal (kırmızı daire) Uncaged ortaya çıkmıştır etki alanı (beyaz daire). B), parapineal (kırmızı daire içinde Uncaged floresein sinyali zenginleştirilmiş) ve pineal organ (beyaz daire) .

Discussion

Açıklandığı gibi, bu protokol, mikroenjeksiyon, mikroskopi ve immünofloresan sık kullanılan teknikler üzerine inşa edilmiştir zebrafish nispeten hızlı bir soy etiketleme yöntemi sağlar. Biz lazer yerelleştirilmiş bir moda flöresein uncage için en verimli ve maliyet etkin yolu olarak uncaging olduğunu bulduk. Bu yöntem 4 dpf'e gibi geç olarak deneysel uç noktaları ile soy etiket olabilir. Ancak, hücre bölünmeleri gibi, hücre başına kafesli-floresein toplama sonunda saptanabilir düzeylerde ötesinde azalır. Buna ek olarak, zebrafish larvaları ¹¹ flöresein spontan, non-spesifik uncaging bildirilmiştir. Uncaged floresein gibi, algılama, en erken larva aşamasında etkili (48-72 hpf) veya daha önceki gibi.

Bizim tercih uncaging yöntemi darbeli azot lazer kullanımı. Bunlar genel olarak, hücre ablasyonların deneyleri için kullanılan ve singe hücre veya hücreleri küçük ^gruplar 11-12 uncage yeterince doğru vardır . Ancak, aynı zamanda uncaging konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir; iki foton konfokal mikroskoplar çok hassas uncaging ¹² elde etmek için kullanılmaktadır. Hassas gerekli değilse Yelpazenin diğer ucunda, daha sonra lazer vazgeçilebilir. ¹¹ üzerinden küçük bir iğne deliği uncage DAPI filtre seti ile donatılmış bir epifluorescent mikroskop kullanılabilir.

Biz bu algılama, kırmızı ya da uzak-kırmızı dalga boyu (örneğin Alexa 633) bizim ihtiyaçlarımıza en uygun yayan bir birincil antikor ve floresan ikincil antikor kullanarak Uncaged flöresein bulduk. Bu bize, transgen (Şekil 1) tarafından ifade GFP Uncaged floresein ayırt etmek için izin verir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3