Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

Summary

צומת neuromuscular (NMJ) של

Abstract

Neuromuscular הזחלים תסיסנית צומת (NMJ) הוא מודל מצוין לחקר מבנה ותפקוד הסינפטי ו. תסיסנית ידועה הקלות של מניפולציות גנטיות חזק ומערכת העצבים הזחל הוכיחה שימושי במיוחד ללמוד לא רק על התפקוד התקין אלא גם הפרעות המלווים כמה מחלות נוירולוגיות (לויד טיילור, 2010). רבים מולקולות הסינפטי המפתח נמצא תסיסנית מצויים גם יונקים כמו רוב CNS סינפסות מעוררות אצל יונקים, NMJ תסיסנית הוא glutamatergic ומדגים פעילות תלויי שיפוץ (Koh et al., 2000). בנוסף, נוירונים תסיסנית ניתן לזהות בנפרד כי דפוסי העצבוב שלהם סטריאוטיפי וחוזר על עצמו כך שניתן ללמוד המסופים הסינפטיים מזוהה, כגון אלה בין הנוירונים המוטוריים בגוף קיר סיבי השריר שהם innervate (Keshishian וקים, 2004). קיומם של מרכיבים סינפסה שמור באבולוציה, יחד עם הקלות של מניפולציה גנטית ופיזית הדגם תסיסנית אידיאלי לחקור את המנגנונים פונקציה הסינפטי (Budnik, 1996).

אזורי הפעילות במסופים הסינפטי הם בעלי עניין מיוחד, כי אלה הם האתרים של שחרור הנוירוטרנסמיטר. NC82 היא נוגדן חד שבטי המזהה את החלבון תסיסנית Bruchpilot (Brp), חבר משפחה CAST1/ERC כי היא מרכיב חשוב של אזור פעיל (Wagh et al. 2006). Brp הוצגה ישירות לעצב את אזור פעיל T-בר אחראי ביעילות באשכולות Ca ^{2 +} ערוצי מתחת צפיפות T-בר (פוקה et al. 2009). מוטציות של Brp צמצמו Ca ^{2 +} צפיפות הערוץ, שלפוחית ​​מדוכא שחרור עורר, ואת הפלסטיות שינה לטווח קצר (קיטל et al. 2006). שינויים לאזורי פעיל נצפו דגמים תסיסנית המחלה. לדוגמה, immunofluorescence באמצעות נוגדן NC82 הראו כי צפיפות אזור פעיל צומצם במודלים של טרשת לרוחב amyotrophic ופיט-הופקינס תסמונת (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. לפיכך, ההערכה של אזורי פעילות, או חלבונים סינפטיים אחרים, מודלים תסיסנית זחלים של המחלה עשויה לספק רמז ראשוני ערך לנוכחות של פגם הסינפטי.

הכנת כל הר גזור הזחלים תסיסנית לניתוח immunofluorescence של NMJ דורש מיומנות מסוימת, אך ניתן להשיג על ידי רוב המדענים עם קצת תרגול. מוגש היא שיטה המספק עבור הזחלים מרובים כדי להיות גזור ו immunostained בצלחת לנתיחה אותו, הגבלת הבדלים סביבתיים בין גנוטיפ כל ומתן חיות מספיק אמון שחזור וניתוח סטטיסטי.

Protocol

1. הכנה immunofluorescence:

1. כדי ליצור משטח לנתח, לשפוך Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון לתוך צלחת קטנה רקמת תרבות. הקפד לא למלא את הצלחת לחלוטין כך שאזור לנתיחה נמוך יותר שולי.
2. חתוך סיכות לנתיחה לאורך של כ 3.5 מ"מ על מנת להקל מוגברת של מניפולציה, וודא שיש לפחות 6 פינים לכל זחל.
3. יהיה עליך מלקחיים בוטה שיאפשרו לך לתפוס את הפינים לנתיחה.

2. Dissection של הזחלים:

1. בחר נדודים third הזחלים instar כי הם זוחלים סביב צדי הבקבוקון ולא החלו pupate.
2. הצב זחל על פני דיסקציה תחת stereomicroscope. וויק משם moister עודף באמצעות Kimwipe.
3. סדר כל זחל כך את הצד הגבי הוא פונה כלפי מעלה. תוכל לראות שני קנה הנשימה, קווים לבנים בצד הגבי של הזחלים. נסו מרכז אלה באמצע ככל האפשר כי זה מסמן את קו האמצע הגבי.
4. מקום להצמיד # 1 בדיוק מעל הפה ווים (איור 1).
5. מקום להצמיד # 2 בזנב בדיוק מעל spiracles בין tracheae.
6. הוספת כמות קטנה של PBS על הזחלים כדי למנוע התייבשות לציפורן.
7. חזור על השלבים לעיל עם זחלים כל, לוודא כי גנוטיפים מופרדים מרחבית על ידי הצבת סיכה בין גנוטיפ אחד.
8. פנו ימינה קטן חתך רוחבי מעל סיכה מס '2 על פני שניהם וקנה הנשימה (איור 1).
9. הכנס מספריים שלך לחתוך את החתך הראשון לאורך קו האמצע הגבי בין וקנה הנשימה כל הדרך עד פינים בעבר # 1.
10. יהיה עליך לבצע חתכים קטנים אחרים בתחתית הדף מאוד של כל צד של לציפורן, כך הצדדים על ימין ועל שמאל יפתח המאפשר לך להצמיד אותם ללא משיכת לציפורן.
11. מקום להצמיד # של 3, 4, 5, ו -6 בכל פינה.
12. תקן את המדגם עם PFA 4% עבור 20-25 דקות בטמפרטורת החדר
13. למזוג PFA ולשטוף עם 3-4 פעמים PBS, decanting בכל פעם.

3. הסרה של רקמה:

1. התחל על ידי הסרת רקמות בקצה האחורי כי בדרך כלל אתה רוצה להגן על האזור שבו נמצא המוח.
2. תוך שימוש steromicroscope עם הזחלים תחת ירידה של PBS, הראשון לתפוס את הקצה האחורי של אחד קנה הנשימה ולשלוף אותו החוצה אשר עשוי להסיר חלק של הגוף את השומן עם זה. חזור על קנה הנשימה עבור השני.
3. תפוס כמה שומן הגוף המעי האחורי או למשוך אותם מתוך הכנה. לאחר שרוב רקמת האחורי הוסר, להתמקד בהסרת רקמות קטנות סביב המוח. אם אתה מעוניין רק את השרירים, או המורפולוגיה של NMJ ניתן להסיר את המוח גם.
4. הסרה של המוח מאפשר ראיה טובה יותר של 31 שרירים, אשר מהווה סמן מועיל אוריינטציה קטע הבטן.

4. Immunofluorescence עבור אזורי פעילות:

1. הוסף את סוכן חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב PBS) ל preps גזור בצלחת לנתיחה. חסום במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. אם אתה רוצה לעשות רק פתרון אחד עבור חסימת נוגדן דילולים, כולל 0.1% TritonX-100 לסוכן חסימת שלך permeabilization רקמות.
2. החל את הנוגדן ראשי מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100. הנוגדן אזור פעיל ניתנת להשגה דרך התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). השתמש נוגדן התייחסות (למשל חזרת peroxidase-Cy3 המצומד) לתווית קרום NMJ וגם אקסונים.
3. דגירה נוגדנים העיקרי ב 4 ° C למשך הלילה. אז זה היובש של המקרר לא יתאדה הפתרון נוגדן, ליצור תא לחות על ידי הצבת קצת מים בחלק התחתון של תיבת בשימוש קצה פיפטה. מכסים את מכסה שקוף עם רדיד אלומיניום כדי להפחית את הניאון הלבנה. מניחים את השקופית לנתיחה בתא לחות לשים את הקופסה כולה ב 4 ° C חממה לילה.
4. למחרת בבוקר, לשטוף עם PBST (PBS עם 0.2% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד.
5. דגירה עם נוגדן המשני (למשל עיזים Invitrogen אלקסה אנטי Mouse-488) מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 2-4 שעות בחדר מכוסה לחות. כלול כתם גרעיני (למשל DAPI) ב המשני, אם אתה רוצה לזהות את המיקום של גרעין בשרירים או המוח.
6. לשטוף עם PBST (PBS עם 0.02% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד.

5. הרכבה דוגמאות הזחל על שקופיות:

1. למזוג ואת הפתיל את לשטוף PBST האחרון.
2. פיפטה גליצרול 80% 1mL כ לכסות את פרוות הזחל מרותקים.
3. הסרה של 5 מתוך 6 סיכות הזחלים כל.
4. כאשר אתה מוכן לשים את גנוטיפ הראשון בשקופית להסיר את הסיכה האחרונה הזחלים כל genoty כיPE.
5. הכן שקופית "לשטוף" על ידי הצבת שתי טיפות בינוני הרכבה שלך בשקופית נקי. שלב זה חשוב לשטוף את הפתרון מים את הזחלים עבור הרכבה וברורה הדמיה.
6. לתפוס את אחד הזחל בזנב עם מלקחיים הבוטה שלך, גרור את הזחל סביב גליצרול ולאחר מכן בשולי יבש מנה דיסקציה שלך, להסיר את רוב גליצרול. מניחים את הזחלים לירידה בינונית הראשון גובר.
7. חזור על שלב 6 עבור כל הזחלים של גנוטיפ זהה.
8. לאחר כל הזחלים נמצאים ירידה בינונית הראשון גובר, לתפוס את הזחל הראשון הזנב ולמשוך אותו דרך ירידה, ואז בשולי יבש הצלחת להסיר רוב של המדיום. אז במקום הזחלים לירידה בינוני השני גובר.
9. חזור על שלב 8 עבור הזחלים כל עם גנוטיפ זהה.
10. הכן את השקופית הסופי שלך על ידי תיוג זה הצבת קטן בצורת "T" של המדיום הרכבה בשקופית.
11. כמו בשלב 5.8, לתפוס את הזחל בזנבו; למשוך את העור באמצעות ירידה בינונית השני גובר ולאחר מכן בצדי יבש של השקופית "לשטוף". לאחר שרוב בינוני הגיע משם, במקום לזרוק הזחל בשקופית האחרונה המדיום גובר.
12. חזור לכל פרוות הזחל.
13. ודא כי כל פרוות הזחל מסודרים לפי הצורך לוודא שהצד לציפורן הוא מטה את השריר חשוף הוא פונה כלפי מעלה.
14. מניחים פיסת לכסות בשקופית כדי לכסות את הזחלים גזור, עם קצה ההתחלה בשורה העליונה של "טי"
15. שים משקל קטן (למשל 9 וולט סוללה) על להחליק את המכסה, ולוודא כי המדיום הרכבה מתפשט לחלוטין תחת להחליק את המכסה.
16. כדי להפחית מרווה פלורסנט האפשר, במקום להחליק במגירה או מקום חשוך עד בינוני הרכבה ריפא.
17. לנקות את המדיום הזה גובר על גדותיו קצוות של להחליק את המכסה. נקה את עודפי בינוני הרכבה יבש על להחליק את מכסה או שקופיות עם אתנול 70%.
18. כדי ליצור חותם סופי, חותם עם לציפורניים.

6. נציג תוצאות:

שקופית דוגמה הזחלים גזור ו immunostained מוצג באיור 2. כאשר והניתוחים זחלים, כתמים, הרכבה מתבצעים כראוי, המשתמש יכול לזהות את שריר זחלים של עניין (איור 3) במגזרי A2-A6. הואנג et al. מספק תיאור מפורט של עמדת שרירים, כמו גם אפיון של boutons סינפטי ספציפי (Hoang ו צ'יבה, 2001). שימוש למטרה מתח גבוה המשתמש יכול להתמקד סינפסה אחת ולקחת Z-מחסנית התמונה. מקסימום נציג הקרנת תמונה של חלק סינפסה 6 / 7 מוצג (איור 4). לאחר מכן באמצעות תוכנת הדמיה, אזורים פעילה ניתן להעריך כמותית עבור המאפיינים כי הם במיוחד פנוטיפ מוטנטי שלך. דוגמאות של תכונות שעשויות להשתנות פנוטיפ מוטנט מסוים לכלול את המספר הכולל, עוצמת flourescence, ואת המרווח בין אזורי פעיל.

פוטנציאל החסרונות:

הערכה immunofluorescence לצומת neuromuscular הזחל היא מערכת יקר שיכול לספק תובנה חשובה בביולוגיה הסינפטי, אם כי יש בעיות פוטנציאליות שיכולות להגביל את השירות של מערכת זו. לדוגמה, לעתים קרובות רצוי התמונה דפוס מכתים של שניים או יותר נוגדנים העיקרי מדגם זהה. הבחירה העיקרית של נוגדנים מתאימים, fluorophores המתאים, בקרות שליליות מתאימות חיונית להצלחה.

אם הדמיה two אנטיגנים בניסוי שלך, להיות בטוח כי נוגדנים העיקריים הם ממינים שונים, כך שכל חלבון של עניין ניתן לזהות באופן ייחודי עם נוגדן משנית שכותרתו fluorescently. הדרך המומלצת כדי להפחית את הרקע היא להשתמש סוכן חסימת המכיל את בסרום נורמלי של המין שממנו נגזרו משני נוגדנים (למשל להשתמש בסרום עז נורמלי כסוכן חסימת בעת השימוש עז נגד ארנב או עכבר אנטי נוגדנים משני).

לאחר תכנון נוגדנים ראשוניים ומשניים כי תשתמש בניסוי שלך, עליך לשקול גם כולל בקרות מכתים שלך קובע כדי להבטיח את האות ניאון שאתם רואים הוא אמיתי ולא רק רקע. במידת האפשר, כולל דגימות בקרה שלילית שאינם מכילים את החלבון של עניין. זה נעשה בקלות על ידי בעל חיים, כולל סוג בר במחקרים של overexpression transgene אקסוגניים, אך במקרים מסוימים ניתן לבצע באמצעות מוטציה הומוזיגוטים של חלבון העניין שלך. עוד לשלוט שלילי חיוני, שימושי למדידת רמות הרקע של האות ניאון שלך, היא להשתמש נוגדנים משני ללא לרבות הראשי. כאשר preps הדמיה וכתוצאה שלך, חשוב להבין כי כל אות ניאון שאתם רואים לא יכול להיות אמיתי, יכול להיות הרקע יונוגדנים משני ur או מרקע רקמות אנדוגני. ייתכן שיהיה עליך לנרמל את התמונות שלך לשקול הקרינה רקע כאשר assaying לשינויים בין עוצמת הקרינה.

בחירת fluorophore חייב להיות גם עם טיפול. בחינת עירור לבין ספקטרום הפליטה fluorophore כל יכולת ייחודית לזהות כל אות היא חיונית כדי למנוע דימום דרך הערוץ. אם יש חוסר ודאות, דרך פשוטה לקבוע אם היקף לדמם דרך היא immunostain עם נוגדן fluorophore שכותרתו אחד בכל פעם, לבדוק את התמונה עם כל ערוץ כי תשתמש בניסוי הסופי. זה צריך לגלות אם לדמם דרך מתרחש עם סט מיקרוסקופ מסנן שלך.

באיור 1. תרשים זרימה של חיתוך לציפורן והמיקום של סיכות 1-6. לחץ כאן כדי להציג תמונה מוגדלת

איור 2. המיקום של הזחלים בשקופית האחרונה. ודא preps הזחלים נחשפים לצד שריר מעלה מטה בצד לציפורן. השאירו לפחות רוחב גוף הזחל שביניהם מדגם זה.

איור 3. כאשר הדמיה, לאתר את השרירים קטעים של עניין. בצמתים neuromuscular נפוצות מאופיין השרירים innervate 6 / 7, 13 שרירים, 12 שרירים, או שריר 4. בצד השני של קו האמצע הגחון, יש תמונת ראי שריר המבנה של קטע, חמי המוצג. השתמש שרירים 31 כסמן לזהות איזה קטע שאתה הדמיה. תמונה הסינפסות אותו וקטעי לשארית דגימות שלך, איסוף תמונות סינפטיים רבים לכל גנוטיפ שניתן להשתמש בהם עבור כימות.

איור 4. המרבי נציג הקרנת תמונה של חלק של שריר NMJ innervating 6 / 7 מוצג. NC82 (Bruchpilot) מכתים מוצג ירוק. HRP מראש הסינפטי כתם מוצג באדום. שים לב punctae אזור פעיל כי ניתן לכמת עוד יותר על ידי תוכנת הדמיה.

Discussion

עבור נוירונים, אזור מסוף סינפטי היא בעלת חשיבות קריטית, הוא הגשר תקשורת נאותה בין הפוסט לבין מראש הסינפטי התאים. דרך רבת עוצמה כדי לחקור את בריאותם של הנוירון במודלים של המחלה היא לנתח חלבונים של המסוף הסינפטי ידי immunofluorescence. השיטה המוצגת כאן immunofluorescence מאפשרת לחוקר לבחון זחלים רבים בו זמנית תוך צמצום הבדלים סביבתיים בין הקבוצות. מערכת העצבים המרכזית של הזחלים שלישי instar תסיסנית יש יתרונות רבים כולל סינפסות glutamatergic, ממופה וחזר מסופי הסינפטי, הנגישות, שחזור והעוצמה של מניפולציה גנטית. במיוחד במודלים תסיסנית מחלה עצבית, רמות החלבון הפעיל אזור Bruchpilot השתנה. בגלל מספר רב של זחלים assayed בו זמנית, את הניתוח לאזור פעיל בשיטת הציג מאפשרת לחוקר לזהות הבדלים דקים בין הקבוצות יכול לשקף פגם מהותי לבריאותם של הנוירון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	68037-59-2	After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more.
Stainless Steel Minutien PIns	Fine Science Tools	26002-10	Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins)	Fine Science Tools	11223-20	Use as blunt forceps for grasping pins
Dissection Forceps	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long	World Precision Instruments, Inc.	501778
Mouse anti-Brp antibody	DSHB	NC82	Use 1:50 dilution
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Use at 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11001	Use approx. 1:200 dilution