Summary
Bir göstermektedir.
Abstract
Ortabeyin RGC projeksiyonlar hedefleme ve arıtma gelişimi sırasında nöral bağlantı formunun ne kadar hassas desenler çalışmak için popüler ve güçlü bir model sistem. Farelerde, retinofugal projeksiyonlar, talamus ve Superior Colliculus (SC) Lateral genikulat Nucleus topoğrafik bir şekilde ve form göz belirli katmanlarına (dLGN) düzenlenir. Retinofugal projeksiyonlar bu kesin desen gelişimi genellikle horseradish peroksidaz 1-4 gibi floresan boyalar ve izleyiciler ile RGCs nüfusu, etiketleme çalışılmıştır. Ancak, bu yöntemler retinotopic harita oluşumunun temelinde bireysel RGC aksonal çardak morfolojisi gelişimsel değişiklikler içgörü sağlamak için çok kaba. Ayrıca RGCs genetik manipülasyon için izin vermez.
Son zamanlarda, elektroporasyon 5-11 retina içine yüklü moleküllerin teslimat için mekansal ve zamansal hassas kontrolü sağlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir. Şu retina elektroporasyon protokolleri genetik manipülasyon için izin ve doğum sonrası farelerde RGCs, tek ya da küçük bir kümenin retinofugal projeksiyonları izleme yok. In vivo elektroporasyon postnatal RGCs transfecting etiketleme verimliliği son derece düşük olduğu için uygulanabilir bir yöntem değildir ve bu nedenle embriyonik yaşta RGC atalarıdır farklılaşması ve proliferasyonu 6 geçiren hedef gerektirir öne sürülmüştür .
Bu video için in vivo elektroporasyon protokolünde hedeflenen gen teslimat, shRNA ve postnatal fare RGCs floresan dextrans açıklar. Bu teknik, dallanma, laminasyon, yenilenme ve devre geliştirme çeşitli aşamalarında sinaps oluşumu, akson retraksiyon da dahil olmak üzere sinirsel gelişimi çeşitli yönleri yer alan aday genlerin etkin bir tarama için hızlı, etkin maliyetli ve nispeten kolay bir platform sağlar. Özet olarak biz burada duyusal harita gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları içine daha fazla bilgi sağlayacak değerli bir araç açıklar.
Protocol
1. Set-up Elektroporasyon için ekipman
- Elektrotlar: Biz Dumont elektrotlar olarak kullanmak için # 5 forseps güncellenmiştir.
- Ayrı ve forseps parçalayın.
- Lehim her dişine daha geniş sonunda bir tel. Tel bağlanmış ve yalıtım bandı ile dişleri maruz çatallı ucu yaklaşık 25-30 mm bırakarak sarın.
- Modifiye forseps bahar eylem sağlamak için uygun plastik iki dişleri arasında herhangi bir boşluk (örneğin, bir düğme) ile tekrar bir araya koyun.
- Elektrik donatımı: Biz, teslim olmak bakliyat dalga ve numarayı onaylamak için elektroporasyon ve osiloskop ve ses monitör için geçerli bakliyat sunmak için bir elektrik stimülatörü kullanın .
- Stimülatör ile seri bağlı bir ayak pedalı forseps biri diş teli bağlayın. Ayak pedalı bir anahtar olarak görür. Zaman depresif devre elektroporasyon için tamamlar.
- Diğer diş elektrik stimülatörü tel bağlayın.
- Stimülatörü osiloskop ve ses monitör bağlayın.
- Set-up mikropipet ve enjektör: Biz doğrudan retinanın içine boya veya DNA çözümü çok küçük hacimlerde enjekte etmek için, keskin cam pipetler çekti ve Nanoinject II enjektör sistemi kullanın .
- 3-eksenli mikromanipülatör Mount enjektör sistemi.
- Uzun konik ve küçük ucu cam pipetler çekin.
- Geri (ayrıntılar Nanoinect II kullanım kılavuzu görmek için), madeni yağ ve güvenli enjektör ile çekilir pipet doldurun.
- Keskin microdissecting makas kullanarak küçük bir açıklık (~ 2-3 mm), pipet ucu kesilmiş.
- Pipet, pipet ucu ile enjeksiyon çözüm istenilen miktarda doldurun. Sürece ucu bütünlüğünü tutan, çoklu enjeksiyon ve hayvanlar için kullanılır.
Not: i) yeterli enjeksiyon çözüm yeniden toprakla mineral yağ, göz içine enjekte asla böyle ipuçları yüklü olduğundan emin olun. ii) Nanoinject II sistemi ve bu videoda kullanılan özel elektronik cihazlar RGCs başarılı bir şekilde etiketlenmesi ulaşmak için kritik değildir. Gibi diğer ortak uyarıcıları picospritzer ve elektroporasyon gibi diğer cihazlar ile yapılan Enjeksiyonlar etiket RGCs de kullanılabilir.
2. RGC Etiketleme Plazmid Çözümler
- RGCs küçük kümeler etiketleme: CAG organizatörü (CMV derhal erken arttırıcı tavuk β-aktin organizatörü) kontrolü altında bir yapı kodlama EGFP (~ 2-3 mikrogram / mcL) gelişmiş yeşil flüoresan protein) kullanırlar. EGFP, hücre zarı (mut4EGFP) 12 hedeflemesi GAP-43 palmitoylation dizisi (büyüme ilişkili protein-43) ile etiketlenir . Bu yapı pCAG-gapEGFP olarak adlandırılır.
- Tek bir hücre için etiketleme: Biz iki yapıları bir arada kullanın. Ilk vektör Cre recombinase (pCAG Cre, Addgene [Cambridge, MA] plazmid 13775) 13 ve ikinci vektör hedeflenen EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP) membran tarafından takip floxed DUR kaset içeren sürüş CAG organizatörü. pCAG Cre (~ 0.15-ng/μL) (gereğince hücrelerin az sayıda güçlü EGFP ifade hapsetmesi pCAG-LNL-gapEGFP (1-2 μgμL) 'den yaklaşık 1,000-10,000 kat daha düşük konsantrasyonda nispeten düşük pCAG Cre konsantrasyon).
3. Retina Enjeksiyon ve Elektroporasyon Protokolü
- P5 daha yaşlı farelerin intraperitoneal ketamin (4,28 mg / ml), ksilizin (0.82 mg / ml), bir kokteyl (0.7 ml / kg) ile anestezi ise postnatal gün P5 yavrular 0 (P0), hipotermi ile anestezi ve acepromazine (0.07mg/ml) 14.
- Cerrahi aletler ve sıcak bir boncuk sterilizatör tüm elektrot ipuçları sterilize edin. Daha sonra göz termal zarar vermemek için kullanmadan önce steril serum fizyolojik hem de serin.
- Bir diseksiyon kapsamı ve pozisyon enjektör altında yer fare.
- P14 (göz açmadan önce) daha genç fareler için, cerrahi mikro diseksiyon yaylı makas b ile gelecekteki göz kapağı açma boydan boya keserek göz kapağı açın .
- Göz küresi kısmen forseps c ipuçları ile göz çevresinde hafifçe basınç uygulayarak çıkıntı olun.
- Bir yerde göz göz küresi çevresindeki deri hafifçe sıkıştırılarak tutun.
- Mikromanipülatör ayarlayın ve göz küresi yakın pipet getirmek.
- Basın ayak pedalı, Nanoinject II sistemi, enjeksiyon solüsyonu birkaç damla sınırdışı ve böylece pipet tıkalı olmadığını doğrulamak için bağlı.
- Bir yandan göz küresi stabilize, cam pipet ucu, retinal pigment epiteli ile deler ve retina girdiği mikromanipülatör hareket ettirin.
- Des enjekteNanoinject II sistemi için ayak pedalına basarak çözüm ired miktarı. Örneğin, 2.3-4.6nL tek bir enjeksiyon yapmak tek RGCs etiket.
- Pipet geri çekin ve dikkatli bir şekilde enjeksiyon sitesi üzerinden doğrudan elektrot ipuçları ve devreyi tamamlamak ve göz electroporate Stimülatörü için ayak pedalına. Biz genellikle 25V gücü, 50 milisaniye süresi, ayrı 1sn ayarları kare darbeleri kullanın. 10 bakliyat (5 bakliyat her polarite) P4 daha eski ve 6 bakliyat (3 bakliyat her polarite) P3 fareler P0 için uygulanan farelerde uygulanır.
- Sokete yavaşça geri itin göz küresi ve kesme göz kapaklarının üzerine steril oftalmik merhem uygulayın.
- Yeri hayvanlar, sıcaklık kontrollü bir ısı pedi ve yeterli rewarming ve hareketliliği de dahil olmak üzere tam iyileşme, anneleri hayvan dönün.
- Hayvanları, hareket kaybı, anormal postür veya damat yetmezliği gibi ağrı, sıkıntı veya rahatsızlık, herhangi bir işaret için her 12 saatte bir izleyin. Anestezi, enjeksiyon ve elektroporasyon Tekrarlanan mermi aynı hayvan üzerinde yapılan olmamalıdır.
4. Notlar
- Bu video açıklanan enjeksiyon yöntemi 'kör' bir enjeksiyon. Albino fareler ve renkli çözeltiler (DII veya hızlı mavi eser miktarda plazmid çözüm) ile çalışırken enjeksiyon miktarı ve konumu görselleştirmek mümkündür. Ancak, pigmentli fareler suşları ile enjeksiyon konumunu doğrudan canlandırılabilen olmayacak ve dolayısıyla sözlü bir retina amaçlanan konuma ulaşmıştır ya da ne kadar bir özellikle RGC katmanı hedef pipet hareket edip etmemesi gerektiğini tarif etmek zordur. Bu nedenle, bu enjeksiyonları, retinanın hemen görüntülenmiştir olabilir çünkü ilk albino farelerde DII enjeksiyonları ile başlatmak için yeni kullanıcılara tavsiye ve RGC retina projeksiyonları ve beyin etiketleme enjeksiyon kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Odak enjeksiyon için% 10 DII N, N-Dimethylformamide (% 100) hazırlayın. Bir kere bu yordamı hakim kullanıcılar RGCs pigmentli farelerde açık DNA plazmid çözümleri ile sürekli hedef olmalıdır.
- Bu video açıklanan enjeksiyon yöntemi retinotopy (4.6nL etiketler birkaç yüz RGCS) 14 çalışma ve konjuge fluorophores (Alexa555, 488, vb.) Toplu etiket RGCs hücrelerin küçük popülasyonlarda etiket odak DII enjeksiyonları yapmak için kullanılır. kolera toksin altbirim B # 10 yukarıdaki elektroporasyon adım hariç olmak üzere, göz-özel ayrımı çalışma. Herhangi bir çözüm P14 daha genç fareler için P14 ve 1-2uL daha yaşlı farelerin 2-3uL maksimal toplam enjeksiyon hacmi önerilir.
- Pipetler enjektör pipet montaj ve ucu kırarak önce mineral yağ ile dolgu enjekte takip edilmesi gereken çözümleri ile yeniden toprakla olabilir. Pipetin ucundan yük çok viskoz ve zor genel yüksek konsantrasyonda DNA çözümleri (~ 6ug/uL) kullanarak, bu özellikle yararlıdır.
- Cam pipet tıkandığında, boya (DII) çözümleri için DNA çözümleri ve etanol (% 100) için suya batırılmış bir pamuk çubukla pipet dikkatle silin.
- Gözünün içine enjekte ettikten sonra, göz küresi pipet geri çekin ve tekrar enjekte etmek için ayak pedalına basın. Bu enjeksiyon işlemi sırasında ucu tıkalı olmadığını teyit etmek için. Herhangi bir çözüm reçete ise, enjeksiyon başarılı olmadığını oldukça muhtemeldir. Ancak, bu enjeksiyon başarılı olmadığını mutlak bir işareti olarak alınması gerekir. Çoklu enjeksiyon siteleri ve daha fazla sayıda hücre etiketleme isteniyorsa deneyci yine aynı göz enjekte edebilir.
- Nanoinject kontrol kutusu üzerinde yavaşlatmak için, tek bir RGCs etiketleme için enjeksiyon hızını ayarlamak. Bu da cam pipetler ucu aynı anda hızlı bir şekilde göz küresi retrakte edilirken sistemin çözüm dağıtmak için bu ayarı daha fazla zaman alır gibi retina içine enjekte çözüm miktarını azaltır.
- Göz hasarı (bu iyileşme birkaç gün sonra belirgin hale gelir, göz kanıtlanabilir normalden daha küçük olduğunda) çok kolay olduğundan postnatal gün Elektroporasyon 0 - 3 (P0, P3) fareler ek bakım gerektirir. Bakliyat ve gerilim uygulandığında sayısını azaltarak erken neonatal fareler için tavsiye edilir. P4 sonra, gözbebekleri elektroporasyon zarar daha esnektir.
- EGFP veya RFP deneyimimizi membran hedef sürümleri ('gapEGFP', 12), beyin retinofugal projeksiyonları inceleyerek için değiştirilmemiş GFP çok daha üstün . Ancak, membran hedefleyen bir değişiklik yoksun pCAG-tdTomato, aynı zamanda iyi çalışır (Şekil 1E). Buna ek olarak, dekstran konjuge floresan boyalar de yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolünü kullanarak etiket RGCs kullanılmalıdır.
- Tipik olarak, 10 enjeksiyonları 9 çift plazmid yaklaşımı ile, etiketli RGCs enjeksiyon rağmen sadece yaklaşık% 15 yol açacaktır ederetiketli olan sadece tek bir RGC sonuçlanabilir. , Bir gözü birden fazla yerde DNA enjekte veya her bir gözüne farklı floresan proteinleri kodlayan plazmid enjekte edilerek başarılı vakalarının sayısı artırılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
RGC etiketleme elektroporasyon sonra 24 saat ile RGCs EGFP etiketleme ile P2 P25 arasında değişen, her yaşta gözlenen ve en az üç hafta sonra transfeksiyon ifade muhafaza.
Floresan etiketli dendritler (Şekil 1A, B) ve tek RGCs aksonal milleri (Şekil 1F) açıkça görüntülenebilmekte ve yeniden inşa edilebilir.
Apart RGCs, bu teknik, yatay hücreler, bipolar hücreleri ve çeşitli amacrine hücre alt tiplerinin (Şekil 1C) gibi diğer retinal hücre tipleri etiket için kullanılabilir
Bu yöntem, SC (Şekil 1E) normal retinotopy gösterdiği görsel harita arıtma normal süre içerisinde müdahale etmiyor.
Her yaştan, olguların yaklaşık% 90, pCAG-gapEGFP küçük hacimli enjeksiyon (~ 2.3-4.6nL), bir kaç RGCs (Şekil 1D) ifade yol açtı.
Retina nöron etiketleme RGCs (Şekil 1A, B, D) ve amacrine gibi diğer hücre tipleri de dahil olmak üzere tek yol, pCAG-Cre ve hayvan başına pCAG LNL-gapEGFP kombinasyonu plazmid tek bir enjeksiyon kullanılarak çalışmaların yaklaşık% 15 hücreleri (Şekil 1C).
Şekil 1 - A, EGFP B. Örnekler düz bir montaj retinada tek retina ganglion hücrelerinin (ok başı akson işaret) doğum sonrası 14. günde (P14) etiketli P8 tek dolup taşan amacrine hücre C. Örnek D. Bir küme, sağ göz E. Dorsal ve ventral RGCs P14 az düz bir montaj retinada RGCs ve amacrine hücreler de dahil olmak üzere EGFP etiketli retinal nöronların electroporated ve EGFP ve sol göz temporal ve ventral RGCs etiketli elektrolizle edildi. P1 tdTomato ile etiketlenir. Etiketli RGCs tarafından oluşturulan hedef bölge (yıldız) topografik doğru P9 SC konumu (tüm montaj, beyaz anahat) görülebilir. RGC çardak (2-D projeksiyon) etiketli tek bir EGFP F. Örnek SC sagital kesiti (250 mikron kalınlığında) (noktalı çizgi). Görüntüleri netlik için, (D) ve (F) dönüştürülmüş olan gri tonlama ve ters için. Ölçek bar (mikron): (A) - (D), (F): 100 (E): 500
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video in vivo elektroporasyon protokol gösteren floresan proteinleri kodlayan DNA yapıları ile doğum sonrası farelerde retinal nöronların tek ya da küçük kümeler etiketlenmesi ile sonuçlanır. Önceki çalışmalarda bu elektroporasyon normal RGC akson çardak arıtma karışmadı gösteren, lipofilik boyalarla RGC etiketleme kullanarak dLGN ve SC floresan etiketli RGC projeksiyonları Küçük kümeler benzer projeksiyon modelleri çoğaltılamaz. Biz, normal ve kesintiye görsel haritalar ile çeşitli fare modelleri tek ve RGCs gruplar düzeyinde retinotopic harita analiz etmek için bu protokol kullanılmaktadır.
Bizim sonuçlarımız, doğum sonrası retinada farklılaştırılmış retinal nöronların güvenilir bir in vivo elektroporasyon kullanarak transfekte olabileceğini göstermektedir . In vivo elektroporasyon protokolü postnatal Burada anlatılan bir mekansal ve zamansal olarak sınırlı bir şekilde eş zamanlı etiketleme ve RGCs genetik manipülasyon sağlar . Biz plazmid kodlama Cre recombinase ve floxed DUR dizisi öncesinde floresan muhabiri bir arada kullanarak retinal nöronların etiketleme göstermektedir. Tutarlı tek bir nöron transfeksiyon plazmid muhabiri göre son derece düşük Cre plazmid konsantrasyon ile elde edilir. Utero elektroporasyon karşılaştırıldığında, bu yöntem daha az invaziv ve optik kiazma gecicek gibi erken akson rehberlik etkinlikleri ile karışmaz. Buna ek olarak, viral yaklaşımlara göre, güçlü bir gen ekspresyonu için daha az zaman gerektirir ve daha az toksik. Bu araç misexpression yoluyla brüt yapısal ve sinaptik düzeyde ya da aday gen yıkmak retinofugal projeksiyonlar arıtma ve olgunlaşma aracılık eden hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için etkin ve hızlı bir yöntem sağlar. Vivo hedef RGCs floresan etiket de RGC akson dinamikleri ve fizyolojik özellikleri görüntüleme için in vivo olarak kullanılan iki foton . Özetle, genetik hedef ve in vivo RGCs görselleştirmek için yeteneği postnatal fare görsel sistem devre geliştirme düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları aydınlatmak daha fazla yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
PCAG gapEGFP plazmid Dr. S. McConnell (Stanford, CA) bir hediye oldu. pCAG-tdTomato plazmid Dr. M. Feller (Berkeley, CA) bir hediye oldu. Biz, teknik destek için pilot çalışmalar ve Crair laboratuvar üyeleri iki plazmid Cre / loxP strateji doğrulamak için tek bir hücre etiketleme ve Anne Schohl (Montreal, QC) için iki plazmid strateji kullanımı öneren Dr. Edward Ruthazer teşekkür ederiz. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ve NIH P30 EY000785 (MC) ile desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
