Summary
我们展示一个
Abstract
研资局的预测中脑的针对性和细化，是一种流行和强大的模型系统，研究开发过程中神经连接的形式如何精确的模式。在小鼠实验中，retinofugal预测被安排在一个地形的方式和形式眼特定层在外侧膝状体，丘脑和上丘（SC）的（dLGN）。 retinofugal预测这些精确的模式的发展通常被标记RGC的人口与荧光染料和示踪剂，如辣根过氧化物酶 1-4研究。但是，这些方法都太粗到个别研资局轴突乔木形态的发展变化，是视网膜地图形成的基础上提供的洞察力。他们也不会允许的视网膜神经节细胞的遗传操作。
近日，电已成为一个有效的方法提供精确的时间和空间控制带电分子传递到视网膜5-11。当前视网膜电协议不允许基因操纵和跟踪retinofugal预测产后小鼠的视网膜神经节细胞的单件或小集群。有人认为，产后体内电穿孔是不是一个可行的方法转染视网膜神经节细胞，因为标签的效率极其低下，因而需要针对胚胎研资局祖细胞发生分化和增殖 6时的年龄。
在这个视频中，我们描述了在体内的基因靶向给药，均有产品，以及出生后小鼠视网膜神经节细胞的荧光右旋糖酐电协议。这种技术提供了一种经济有效，快速参与神经系统发育的几个方面，包括轴突回缩的候选基因的高效筛选和比较容易的平台，分支，层压，再生和突触形成电路开发的各个阶段。总之，我们在这里描述的一种有价值的工具将提供潜在的感官地图发展的分子机制的进一步了解。
Protocol
1。成套设备，电穿孔
- 电极 ：我们修改杜蒙＃5镊子作为电极使用。
- 分开，掰开镊子。
- 焊接线，在每个双管齐下。包装线的连接和绝缘胶布离开暴露插脚的一角约25-30毫米的插头。
- 任何合适的塑料垫片之间的两个插脚（如按钮）提供春风行动，把修改的镊子重新走到一起。
- 电气设备：我们使用的电刺激电和示波器和音频监视器提供的电流脉冲，以确认交付的脉冲波形和数量。
- 一系列的刺激，这也是连接到脚踏板连接线的钳爪。脚踏板作为一个开关。忧郁时完成对电的电路。
- 连接导线从其他叉子的电刺激。
- 连接示波器和音频监控的刺激。
- 微管和喷油器设置 ：我们使用急剧拉玻璃移液管和Nanoinject II喷油系统注入极少量的染料或直接到视网膜的DNA溶液。
- 3轴显微式喷油系统。
- 拉一个长锥形和小尖的玻璃吸液管。
- 回填土与矿物油和安全喷油拉吸管（详见Nanoinect II说明书）。
- 使用锋利microdissecting的剪刀一个切吸管尖，创造一个小口（2-3微米） 。
- 填写所需金额注射液通过吸管尖吸管。只要拥有尖端的完整性，它可用于多次注射和动物。
注：i）确保有足够的注射液中的提示，回填矿物油是从来没有进入眼内注入装载。二）Nanoinject II系统和具体的电子设备，在这个视频没有实现RGC的成功标签的关键。也可以与其他设备，如picospritzer和与其他常见的刺激电注射使用标签视网膜神经节细胞。
2。研资局贴标质粒解决方案
- 标签RGC的小群 ：我们用一个CAG启动子（鸡β-肌动蛋白与一个巨细胞病毒立即早期增强子）的控制下的一个构造编码EGFP（〜2-3微克/μL）的增强型绿色荧光蛋白）。 EGFP标记的GAP - 43的棕榈酰化序列定位到细胞膜（mut4EGFP）12（生长相关蛋白43） 。这种结构被称为pCAG - gapEGFP。
- 对于单细胞标记：我们使用了两种结构的组合。第一个向量是一个CAG启动子驱动Cre重组酶（pCAG CRE，Addgene [剑桥，MA]质粒13775）13，第二个向量包含一个floxed停止录像带，有针对性的EGFP（pCAG LNL - gapEGFP）的膜。 pCAG - CRE（〜0.15-ng/μL）使用浓度低于约1,000-10,000倍pCAG LNL - gapEGFP（1-2μgμL），围（凭借强大的EGFP表达的少数细胞相对低的pCAG的Cre浓度）。
3。视网膜注射和电穿孔协议
- 产后当天0（P0），小五幼仔低温麻醉，而年龄比小五小鼠腹腔注射（0.7毫升/公斤），氯胺酮（4.28毫克/毫升），甲苯噻嗪（0.82毫克/毫升）的鸡尾酒麻醉acepromazine（0.07mg/ml）14。
- 在炎热的珠灭菌消毒所有的手术器械和电极提示。随后，双方在无菌生理盐水之前使用，以避免对眼睛的热损伤凉爽。
- 将鼠标下一个清扫范围和位置的喷油器。
- 对于年轻小鼠比P14（之前的眼开），手术打开眼睑，沿微解剖春天剪刀 b未来眼睑开放的整个长度。
- 部分使眼球突出眼部周围轻轻地运用压力钳彗星的提示。
- 握住到位的眼睛，轻轻地捏眼球周围的皮肤。
- 调整显微带来接近眼球的吸管。
- 按下脚踏板，它是连接Nanoinject II系统，驱逐注射液数滴，从而验证，不堵塞吸管。
- 有了一个稳定的眼球的手，移动，玻璃吸管的尖端刺穿通过视网膜色素上皮细胞，并进入视网膜显微等。
- 注入DESIRED金额按脚踏Nanoinject II系统的解决方案。例如，标签我们做一个单次注射2.3 - 4.6nL单一的视网膜神经节细胞。
- 收回的吸管，小心地将电极提示直接在注射部位，并踩下脚踏刺激完成电路和electroporate眼睛。我们通常使用25V的强度，持续时间50毫秒，1秒，除了设置的方波。 10个脉冲（每个极性脉冲）是适用于年纪比P4和6脉冲（每个极性3个脉冲）为P0到P3小鼠的小鼠。
- 轻轻推眼球放回插座和切眼皮，适用于无菌眼药膏。
- 温度控制的热垫和广场上完全恢复，包括足够的复温及流动的动物，返回他们的母亲的动物。
- 监控动物的任何疼痛，痛苦或不适，如损失的流动性，新郎的姿势异常或故障，的迹象，每12小时。麻醉，注射和电的反复轮不应该执行相同的动物。
4。注释
- 在本视频中描述的注射方法是一个“瞎子”注射。这是可能的可视化与白化小鼠和彩色解决方案（DII或质粒溶液与快速蓝色微量）工作时注入的数量和位置。然而，注射位置与色素的小鼠株不能直接可视化，因此它是很难口头描述一个人是否已经达到了预期的视网膜位置或应该把吸管具体目标，研资局层多远。因此，我们强烈建议新用户先开始DII白化小鼠注射，因为这些注射可立即在视网膜上的可视化和研资局预测到视网膜和大脑的标签可以用来注射液的质量评估。准备焦距注射10％DII在N，N -二甲基甲酰胺（100％）。一旦此过程中掌握的用户应该能够始终如一的目标有明确的DNA质粒的解决方案，在色素小鼠的视网膜神经节细胞。
- 此影片中所描述可用于注射的方法，使联络DII注射标签的小种群细胞研究retinotopy（4.6nL标签几百 RGC的）14和散装标签RGC的荧光团（Alexa555， 488等）偶联霍乱毒素B亚基研究眼睛特定的隔离，不包括在上面的＃10电一步。一个最大的2 - 3uL总注入量为小鼠比P14的任何解决方案年轻小鼠P14和1 2uL建议。
- 移液器可回填回填之前用矿物油喷油器上安装的吸管，并打破了尖端注入遵循的解决方案。这是特别有用的，当使用高浓度的DNA解决方案（〜6ug/uL），这是一般非常粘稠，难以负荷从吸管尖的。
- 如果玻璃吸管变成堵塞，染料（DII）解决方案的DNA解决方案和乙醇（100％），在水中浸泡棉签仔细擦拭枪头。
- 眼内注射后，收回的眼球枪头，按下脚踏板，再次注入。这是确认的提示没有得到在注射过程中堵塞。如果没有解决方案是配发的，它很可能注射，没有成功。但是，这不应该被作为一个绝对的迹象，注射没有成功。实验者可能再次注入相同的眼，如果需要多个注射部位的细胞数量较大的标签。
- 单RGC的标签，注射速度要缓慢Nanoinject控制箱。这进一步降低注射到视网膜的系统需要更多的时间，在此设置分发的解决方案，同时玻璃吸液管的尖端正在迅速缩回眼球的解决方案。
- 电穿孔产后一天0到3（P0到P3）小鼠需要格外小心，因为它是很容易损伤眼睛（这已成为明显的恢复几天后，当眼睛明显小于正常）。减少脉冲，并施加电压建议为新生儿早期小鼠。眼球后的P4，更具弹性的损害的电。
- 在我们的经验膜有针对性的EGFP或RFP的版本（“gapEGFP”，见12）都远远优于未修改GFP研究retinofugal预测到大脑。然而，pCAG tdTomato，缺乏针对修改的膜，也是行之有效的（图1E）。此外，还可以用于右旋糖酐共轭荧光染料使用电协议，上面所述的标签RGC的。
- 通常情况下，会导致9 10注射标记RGCs的双质粒的方法虽然只有约15％的注射结果中只是一个被标记的单研资局。一只眼睛的DNA注射在多个地点或注射到每只眼睛不同的荧光蛋白的质粒编码的数量可以增加成功的个案。
5。代表性的成果
标签是研资局在所有年龄段的观察，从P2到P25的范围，24小时在视网膜神经节细胞后，电EGFP标记，并保持对转染后至少三个星期的表达。
荧光标记的树突（图1A，B）和单一的视网膜神经节细胞的轴突乔木（图1F），可以清楚地可视化和重建。
除了RGC的，这种技术可以用来标记其他细胞类型，如视网膜水平细胞，双极细胞，无长突细胞亚型的各种（图1C）
此方法不干扰正常的视觉地图细化SC（图1E）的正常retinotopy证明的时间当然。
在所有年龄段，在90％左右的情况下，小容量注射剂（〜2.3 - 4.6nL）pCAG - gapEGFP导致在少数视网膜神经节细胞（图1D）的表达。
在大约15％的试验使用的pCAG CRE和每个动物pCAG LNL - gapEGFP结合质粒的单次注射，导致单一的视网膜神经元的标签，包括视网膜神经节细胞（图1A，B，D）和其他类型的细胞，如无长突细胞（图1C）。
图1 - B. EGFP的实例标记，在产后第14天（P13）单视网膜神经节细胞（箭头指向轴突）C.在一个平面贴装视网膜的单爆无长突细胞的例子在P8 D。 EGFP标记包括视网膜神经节细胞和无长突细胞在一个平面安装在P14的。E.背，腹右眼视网膜神经节细胞视网膜视网膜神经细胞群电穿孔和EGFP和时间和腹侧左眼视网膜神经节细胞标记电 镀在P1与tdTomato标记。 F.标记的研资局乔木（2 - D投影）在一个单一的EGFP的例子标记视网膜神经节细胞形成的目标区（星号）可以看出，在SC在P9的地形正确的位置（整个安装，白色的轮廓）。一个矢状切面的SC（250微米厚）（虚线）。清晰，图像中（D）和（六）已转换为灰度和倒置。比例尺（微米）：（一） - （四），（六）：100;（五）：500
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Discussion
在这个视频中， 我们证明在体内电协议，结果在与编码荧光蛋白质的DNA的结构，产后的小鼠视网膜神经细胞的单个或小群的标签。小群dLGN和SC荧光标记的研资局预测再现类似的投影模式，以前的研究使用亲油性染料研资局的标签，这表明电不干扰正常的研资局轴突乔木细化。我们利用这个协议在单一和不同的小鼠模型的视网膜神经节细胞组与正常，扰乱视觉地图水平的分析视网膜的地图。
我们的研究结果表明，在产后视网膜有区别的视网膜神经细胞能够可靠地使用在体内电转。产后体内电协议的描述这里可以同时在时间和空间的限制方式的标签和视网膜神经节细胞的遗传操纵。我们证明标签的使用相结合质粒编码Cre重组酶和荧光记者floxed停止序列之前的视网膜神经细胞。通过Cre重组质粒浓度极低记者质粒取得一致的单个神经元的转染。 在子宫内电相比，这种方法创伤小，不干扰早期轴突导向活动，如过路视交叉。此外，相对于病毒的方法，它需要强大的基因表达的时间少，毒性较低。此工具提供了在体内针对视网膜神经节细胞，用荧光标签的调解双方在总的结构和突触通过错误表达水平或候选基因敲retinofugal预测的细化和成熟的细胞和分子机制研究高效，快捷的手段。可用于在体内的双光子成像研资局轴突动力学和其生理特性。综上所述，转基因目标和可视化视网膜神经节细胞在体内的能力产后将有助于进一步阐明在小鼠视觉系统的电路发展的细胞和分子机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
pCAG gapEGFP质粒是博士S.麦康奈尔（斯坦福大学，加利福尼亚州）的礼物。 pCAG - tdTomato质粒博士M.费勒（伯克利分校，加利福尼亚州）的礼物。我们感谢爱德华Ruthazer博士建议使用一个单细胞标记和安妮Schohl验证两个质粒的Cre / loxP位技术支持战略的试点研究和Crair实验室成员（蒙特利尔，QC）的两个质粒战略。 R01 MH62639（MC），美国国立卫生研究院R01 EY015788（MC）和美国国立卫生研究院P30 EY000785（MC）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
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